Sandra+Pisonero


 * Análisis bioinformático del genoma de //Rhodococcus// sp. Clonación, purificación y caracterización de una proteína de la familia Cutinasa. **

Sandra Pisonero Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Biológicas y Ambientales, Universidad de León, 24007, León, España. Trabajo bien elaborado, presentación muy cuidada . El único problema es que ha identificado mal el inicio de la proteína elegida, y todas las construcciones llevan 30 aa a mayores. esa es la razón de ese péptido lider de 60 aa. La mayoría de los péptidos lider tienen alrededor de 20-30 aa. Las bacterias del género //Rhodococcus// pertenecen al grupo de bacterias gram positivas ricas en GC. Tienen una gran distribución en el medioambiente y presentan una extraordinaria capacidad para degradar compuestos orgánicos. En este trabajo se ha analizado un fragmento del genoma de una especie de //Rhodococcus// y en especial una proteína de la familia cutinasa, enzima que presenta una importante aplicación industrial. Se ha llevado a cabo un análisis bioinformático de la misma así como mutagénesis dirigida para conocer si determinadas regiones son importantes para su actividad enzimática. Mediante interrupción génica comprobamos que dicha proteína no es imprescindible para el microorganismo. El gen fue clonado, expresado en //E.coli// y purificamos la proteína mediante una cola de histidina. Gracias a la fusión con la proteína fluorescente verde (GFP) observamos a la proteína anclada a la superficie celular.
 * Resumen **

Las bacterias del género //Rhodococcus// constituyen un diverso grupo de microorganismos que se pueden encontrar comúnmente en muchos nichos medioambientales, desde la tierra al agua del mar y como patógenos de plantas y animales (Larkin //et al//., 1998). Tienen una extraordinaria capacidad para degradar muchos compuestos orgánicos, y dicha característica ha sido objeto de estudio en diversos trabajos (Finkel'shtein //et al//., 2003,Leneva //et al//., 2009). En este trabajo se ha analizado parte del genoma de una especie de //Rhodococcus// y en especial una proteína perteneciente a la familia cutinasa. Esta enzima está presente en algunas especies de //Rhodococcus//, como //Rhodococcus erythropolis//. Las cutinasas (EC 3.1.1.74) fueron descubiertas en hongos fitopatógenos, que crecen sobre cutina como única fuente de carbono. Estas enzimas tienen propiedades catalíticas de lipasas y esterasas y alta estabilidad en solventes orgánicos y líquidos iónicos. Estas características permiten la aplicación de la enzima en diferentes áreas como la industria alimentaria, cosmética, degradación de pesticidas e insecticidas o tratamiento de fibras textiles. (Pio & Macedo., 2009)
 * Introducción **


 * Materiales y Métodos **

Mediante el programa Artemis fueron determinados los distintos ORFs presentes en la secuencia de 17000pb (También se ha hecho uso del programa Pasteur-Sixpack-). Se realizó una búsqueda de promotores a través de “promoter prediction by neural network” dentro de la secuencia de 17000pb. El análisis se centró en la proteína de la familia cutinasa. Se llevó a cabo un alineamiento de la secuencia de la proteína junto a otras proteínas similares, mediante varios programas (MEGA 4.1, ClustalW y MultAlin-ESPript 2.2) y se determinaron los dominios conservados. Se hallaron los puntos de corte para varias peptidasas y enzimas de restricción mediante PeptideCutter (ExPASy) y a través del programa Restriction Maps (http://www.vivo.colostate.edu/molkit/mapper/index.html), respectivamente. Usamos P-fam para determinar a qué familia pertenece la proteína. ProtParam (ExPASy) nos sirvió para conocer las características físico-químicas de la proteína. Para determinar la localización de la proteína usamos el programa PSORTb. SignalP 3.0 server, TMHMM Server v.2.0 y TMpred (ExPASy) fueron usados para la identificación del péptido líder, dominios transmembrana y perfil de hidrofobicidad, respectivamente. La presencia de dominios “coiled coil” se determinó mediante el programa proporcionado por ch.EMBnet.org. Por último, gracias a HNN (ExPASy) se obtuvo la estructura secundaria de la proteína y mediante Phyre (ExPASy) se pudo conocer la estructura terciaria a la que más se asemeja la estructura terciaria de la proteína (la imagen de la estructura terciaria se obtuvo mediante el programa Jmol).
 * Análisis bioinformático**

//E.coli// BL21 (DE3) fue usada como cepa hospedadora para el plásmido recombinante. El plásmido pET45 (Novagen) fue usado como vector de expresión. La cepa recombinante //E.coli// BL21 (DE3) fue cultivada a 18ºC en el medio Luria-Bertani, conteniendo 100µg/ml de ampicilina (Park //et al//., 2008). El plásmido pUC19 (Fermentas) fue usado como plásmido suicida para la interrupción génica en //Rhodococcus// sp. (Navas //et al//., 2001). //Rhodococcus// sp fue cultivado en medio mínimo suplementado con lactato 20mM como ya se describió previamente (Kelly //et al//., 2002).
 * Cepas bacterianas, Plásmidos y Condiciones de cultivo**

El gen fue amplificado mediante PCR usando los siguientes primers: directo (5’-CGCGGATCC ** C **CCGCGCGTGAGTGTGAGCGG-3’) y reverso (5’-CCGCTCGAG TCACTCGTGCGCAGGCGCTG-3’). El producto de la amplificación por PCR fue digerido con BamHI y XhoI y luego purificado. El gen fue insertado en el plásmido pET45 previamente digerido con las mismas enzimas (fig. 1). Después, se transformó //E.coli// BL21 (DE3) con dicho plásmido.
 * Construcción del plásmido de expresión**





//E.coli// BL21 (DE3) transformada con el plásmido recombinante fue cultivada a 18ºC (porqué esa temperatura tan baja para coli, explicación??') en un medio suplementado con ampicilina y se mantuvo dicho cultivo en agitación (230 r.p.m.) hasta que la D.O. a 600nm alcanzó un valor de 0.5; entonces se añadió IPTG hasta una concentración final de 1mM. 100ml del cultivo fueron centrifugados y resuspendidos en un tampón de fosfato potásico. Las células fueron sonicadas y se obtuvo una fracción soluble mediante centrifugación (Park //et al//., 2008).
 * Expresión del gen en //E.coli//**

La proteína, presente en la fracción soluble, fue purificada mediante una columna de Ni-NTA. La elución de la misma se realizó mediante un tampón imidazol 200mM (Park //et al//., 2008). La solución con la proteína fue incubada con enterokinasa toda la noche a 16ºC para separar la cola de His (Dong //et al//., 2008).
 * Purificación de la proteína**

Para comprobar si la proteína presenta actividad cutinasa realmente se realiza una siembra de la cepa recombinante en placas de tributirin agar. La liberación de ácidos grasos debido a la actividad hidrolítica de la cutinasa da lugar a halos alrededor de las colonias (Kok //et al//., 1993).
 * Actividad cutinasa**

La mutación realizada fue Ser173Pro, dentro del dominio cutinasa, en una región conservada. La mutación fue introducida mediante el diseño de los siguientes primers: directo (5’-CGGGCTTCCCC CAGGGCG-3’) y reverso (5’-CGCCCTGGGG GAAGCCCG-3`).
 * Diseño de primers para mutagénesis dirigida**

La amplificación del gen se llevó a cabo por PCR mediante dichos primers y los primers directo y reverso empleados anteriormente (fig. 2).

La actividad enzimática fue determinada usando el sustrato p-nitrofenilbutirato (solución stock 70mM en acetonitrilo). La concentración final de acetonitrilo en cada reacción fue 1,0 % (v:v). El ensayo de la actividad enzimática fue llevado a cabo en Tris-HCl 20mM, pH 8,0 a 30ºC y se inició la reacción por adición de 3nM de la enzima pura. La velocidad de reacción fue determinada espectrofotométricamente mediante la liberación de p-nitrofenol a 400nm (ε = 15400 M-1 cm-1) usando un espectrofotómetro Hitachi U-2000 (Brissos //et al//., 2008).
 * Ensayo de la actividad cutinasa**

Primer1: (5’-CGCGGATCC ** C **CCGCGCGTGAGTGTGAGCGG-3’) Primer2: (5`-CTTCTCCTTTACTCATCTCGTGCGCAGGCGCTG-3’) Primer3: (5`-CAGCGCCTGCGCACGAGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’) Primer4: (5’-CCGCTCGAG TTATTTGTATAGTTCATCC-3’) El producto de la fusión de los dos genes fue amplificado por PCR y clonado en el plásmido pET45 para su expresión en //E.coli// (fig. 3). Se amplificó un fragmento interno del gen usando los primers diseñados mediante el programa Primer3, a los cuales se les añadió zonas de corte de HindIII y EcoRI para su clonación en el plásmido suicida pUC19 (fig. 4). Primer directo: 5’-CCCAAGCTT G ATCCTGGTGCTAGTCGTCGT-3’ Primer reverso: 5’-CCGGAATTC GA AGCCCGTCAACAGATACGTC-3’  qué significan los nt en rojo??? Lo dice mas tarde
 * Diseño de primers para la fusión con la proteína fluorescente verde**
 * Construcción del plásmido suicida**

El plásmido suicida con el fragmento interno del gen fue introducido mediante electroporación en //Rhodococcus// sp. (Navas //et al//., 2001). Después de la electroporación la suspensión bacteriana fue diluida en 1ml de medio Luria-Bertani, incubada a 37ºC durante 2h, y posteriormente se sembró en una placa de medio sólido con ampicilina.

Mediante el programa Artemis obtuvimos los siguientes ORFs de la secuencia de 17000pb:
 * Resultados y Discusión **
 * Análisis bioinformático**

1. Proteína hipotética RHA1 ro4057 (//Rhodococcus jostii// RHA1) 2. Antígeno 85-C (//Rhodococcus erythropolis// SK121) 3. Micoliltransferasa (//Rhodococcus opacus// B4) 4. Proteína hipotética conservada (//Rhodococcus erythropolis// SK121) 5. Proteína hipotética ROP_39400 (//Rhodococcus opacus// B4) 6. FMN reductasa (//Rhodococcus jostii// RHA1) 7. Acil graso de cadena larga AMP ligasa FadD32 (//Rhodococcus opacus// B4) 8. Pks13 (//Rhodococcus rhodochrous//) 9. Acil-CoA carboxilasa. Cadena beta (//Rhodococcus erythropolis// PR4) 10. Proteína hipotética RHA1-ro04687 (//Rhodococcus jostii// RHA1)

Los promotores hallados mediante el programa informático no tienen mucho sentido a la vista de los resultados obtenidos de los ORFs (Tabla 1).

Los promotores, es mejor buscarlos upstream del gen de interés, no en la secuencia total. De todas formas estos programas no son buenos para estos m.o. El estudio se centró en la proteína que se asemeja a la proteína hipotética ROP_39400 de //Rhodococcus opacus// B4, y que presenta la siguiente secuencia de nucleótidos y aminoácidos:

ccgcgcgtgagtgtgagcggccgcggaacgcggaaggtcgggaagaaccgggggcgtaggcgcttcgggatcgtcgcagtgttcgcgacgatcctggtgctagtcgtcgtggcggtgtggtacctgctgg ccgggcgagtgcccgagccggggccgccgacaccgccgggtccgacgccaccggcggcccagccggcggactgccccgacgtccaggtgatctcggtgcccggcacgtgggagtccaacgctgcc gacgacccgtacaacccgacggccaatcccgcgtcgctcatgctcaacgtgacccggccgctgcaggagcgcttctcgccggaccgcgccgacgtctacacggtcccgtacgtcgcgcagttctccaat ccgatcgcgctcccgccggacggccaggagtcgtacaacaattcgcgtgcggccgggaccgcggcgacgatcgacctcatcgagcgccggcacgcggagtgcccgctcacgacgtatctgttgacggg cttctcgcagggcgccgtgatcgcgggcgatgtcgcggcgcggatcggcgccggggacggcccggtgtcgccggatcttgtgctgggcgtcggcgtgatcgccgacggcaggcgtgatcccgccgccgc gccgacgatcgggccgccggtcgccggtgtcggtgcggagctgtcgctcgcggggctgaagctgcccgggatcacgatgaccggtgtgcggccgggaggcttcggagcgctggcggatcgcgcggtcca gatctgtgcccccagcgacggaatctgcgacgcacccgcagaggcgctcaaggtcggcaactggctcagcagcgcgtcgaggttgaccgagtactacaacaatccgatccatgcgatgtacaacacattc gtcgtggacggcaacggcacgaccgccacgcaatggatcacgaactgggccgcggacaagatcgacgcagctccagcgcctgcgcacgagtga

 La proteína empieza en VFATILV.....Porqué ha dicho que la proteína empieza despues del codón de fin y nó despues del codon de inicio

PRVSVSGRGTRKVGKNRGRRRFGIVAVFATILVLVVVAVWYLLAGRVP EPGPPTPPGPTPPAAQPADCPDVQVISVPGTWESN AADDPYNPTANPASLMLNVTRPLQERFSPDRADVYTVPYVAQFSNPIALPPDGQESYNNSRAAGTAATIDLIERRHAECPLTTY LLTGFSQGAVIAGDVAARIGAGDGPVSPDLVLGVGVIADGRRDPAAAPTIGPPVAGVGAELSLAGLKLPGITMTGVRPGGFGAL ADRAVQICAPSDGICDAPAEALKVGNWLSSASRLTEYYNNPIHAMYNTFVVDGNGTTATQWITNWAADKIDAAPAPAHE

Gracias a diversos programas de alineamiento obtuvimos el árbol filogenético en el cuál se incluye el microorganismo objeto de estudio (fig. 5, fig.6), así como los dominios conservados de dicha proteína (fig.7), representados en color rojo oscuro.



Gracias a estos programas podemos determinar que la secuencia de 17000pb procede de un microorganismo del género //Rhodococcus// (fig. 8). Situación taxonómica: Reino: Bacteria Filo: Actinobacteria Orden: Actinomycetales Suborden: Corynebacterineae Familia: Nocardiaceae Género: //Rhodococcus // En la tabla 2 se muestran los puntos de cortes que presenta la proteína para algunas peptidasas. No se encontraron puntos de corte ni para la caspasa9 ni para la enterokinasa.

Se determinaron los puntos de corte de algunas enzimas de restricción, teniéndose en cuenta para la clonación que el gen no presenta puntos de corte para BamHI, XhoI, HindIII o EcoRI (fig. 9).

Mediante el programa Pfam se determinó que la proteína pertenecía a la familia cutinasa, presentando un dominio cutinasa comprendido entre los aminoácidos 66 y 322.

Características físico-químicas de la proteína (ProtParam):

Número de aminoácidos: 330 Peso molecular: 34240.7 pI teórico: 5.47 Composición de aminoácidos (tabla 3). Número total de residuos cargados negativamente (Asp + Glu): 29 Número total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys): 25 Fórmula: C 1522 H 2394 N 428 O 458 S 7 Número total de átomos: 4809 Tiempo de vida estimado: >20 h (reticulocitos de mamífero, in vitro). >20 h (levadura, in vivo).

El programa PSORTb no proporcionó información clara a cerca de la localización celular de la proteína.

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">La proteína presenta un péptido líder, por lo que se trata de una proteína que se secreta al exterior (fig. 10); dicho péptido líder se corresponde con la región hidrofóbica de la proteína (fig. 11, fig. 12).



La proteína no presenta dominios “coiled coil”(ch.EMBnet.org).

La estructura secundaria de la proteína consta de hélices alfa, láminas beta y estructuras aleatorias (fig. 13).

En la fig. 14 se muestra una estructura terciaria semejante a la que podría presentar nuestra proteína (Phyre). Se trata de la acetylxylan esterasa de //Trichoderma reesei// (superfamila alfa/beta hidrolasas, familia similar a cutinasa “cutinase-like”).

En el diseño de primers para la clonación del gen, fue necesaria la adición de un nucleótido para mantener el marco de lectura, el cual se muestra en color rojo. En azul se señalan las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción. Pudimos comprobar que realmente la proteína presentaba actividad cutinasa tras observar alrededor de las colonias un halo, cuando las bacterias eran sembradas en placas de tributirin agar. Gracias a la clonación en el plásmido pET45 pudimos purificar la proteína mediante una cola de histidina, que posteriormente fue liberada de la proteína mediante incubación con enterokinasa.
 * Clonación del gen en el plásmido pET45 y expresión en //E.coli//**

La mutación Ser173Pro dio como resultado una disminución de la actividad enzimática del 45%.
 * Ensayo de la actividad enzimática**

En el diseño de primers para clonar el fragmento interno del gen, se añadieron nucleótidos para mantener el marco de lectura, aunque no haría falta, puesto que el gen no se va a expresar. La interrupción génica se produjo por recombinación simple, tras introducir el plásmido suicida con el fragmento interno del gen en //Rhodococcus// sp (fig. 15). En el medio con ampicilina se observó crecimiento del microorganismo, por lo que se demuestra que dicho gen no es imprescindible para la vida del microorganismo. <span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">Qué fenotipo tendría el mutante?????
 * Interrupción génica**

La fusión de la proteína a la GFP permitió la localización de la proteína en la superficie celular (fig. 16).<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);"> Se secreta o no se secreta? si se secreta no estaría en la membrana
 * Fusión con la GFP**

Este trabajo fue cofinanciando por el Fondo Social Europeo y la Junta de Castilla y León.
 * Agradecimientos **

**Referencias**
 * Brissos V., Eggert T., Cabral J. M., Jaeger K. E. (2008).** Improving activity and stability of cutinase towards the anionic detergent AOT by complete saturation mutagenesis. //Protein Eng Des Sel// **21**, 387-393.


 * Bryson V. & Vogel H. J. (1965).** Evolving genes and proteins. //Science// **147**, 68-71.


 * Dong X., Tang B., Li J., Xu Q., Fang S., Hua Z. (2008).** Expression and purification of intact and functional soybean (glycine max) seed ferritin complex in //Escherichia coli// . //J Microbiol Biotechnol// **18**, 299-307.


 * Finkel'shtein Z. I., Baskunov B. P., Golovlev E. L., Vervoort J., Rietjens I. M., Baboshin M. A., Golovleva L. A. (2003).** Fluorene degradation by bacteria of the genus //Rhodococcus//. //Mikrobiologiia// **72**, 746-751.


 * Kelly B. G., Wall D. M., Boland C. A., Meijer W. G. (2002).** Isocitrate lyase of the facultative intracellular pathogen //Rhodococcus equi//. //Microbiology// **148**, 793-798.


 * Kok R. G., Christoffels V. M., Vosman B., Hellingwerf K. J. (1993).** Growth-phase-dependent expression of the lipolytic system of //Acinetobacter calcoaceticus// BD413: Cloning of a gene encoding one of the esterases. //J Gen Microbiol// **139**, 2329-2342.


 * Larkin M. J., De Mot R., Kulakov L. A., Nagy I. (1998).** Applied aspects of //Rhodococcus// genetics. //Antonie Van Leeuwenhoek// **74**, 133-153.


 * Leneva N. A., Kolomytseva M. P., Baksunov B. P., Golovleva L. A. (2009).** Phenanthrene and anthracene degradation by microorganisms of the genus //Rhodococcus// . //Prikl Biokhim Mikrobiol// **45**, 188-194.


 * Navas J., Gonzalez-Zorn B., Ladron N., Garrido P., Vazquez-Boland J. A. (2001).** Identification and mutagenesis by allelic exchange of //choE//, encoding a cholesterol oxidase from the intracellular pathogen //Rhodococcus equi//. //J Bacteriol// **183**, 4796-4805.


 * Park H. J., Uhm K. N., Kim H. K. (2008).** R-stereoselective amidase from //Rhodococcus erythropolis// no. 7 acting on 4-chloro-3-hydroxybutyramide. //J Microbiol Biotechnol// **18**, 552-559.


 * Pio T. F. & Macedo G. A. (2009).** Cutinases: Properties and industrial applications. //Adv Appl Microbiol// **66**, 77-95.


 * Saitou N. & Nei M. (1987).** The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. //Mol Biol Evol// **4**, 406-425.


 * Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. (2007).** MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. //Mol Biol Evol// **24**, 1596-1599.