Monica+Tascon

Mónica

Trabajo poco elaborado, poca bibliografía La proteína elegida empieza en VHNQ y no donde Ud. dice **

ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNAS DE //Rhodococcus// ** // Mónica Tascón Torres // // Universidad de León, 2009 // En el presente estudio, se ha realizado el estudio y caracterización de una proteína encontrada en una secuencia de DNA correspondiente al microorganismo patógeno productor de zoonosis //Rhodococcus.// La proteína analizada es la proteína extracelular de unión a solutos. **//Palabras clave//**: //Rhodococcus, extracellular solute-binding proteín.// El género rhodococcus se ubica dentro de la Clase Actinobacteria Subclase //Actinobacteridae,// Orden //Actinomycetales,// Suborden //Corynebarterineae,// familia //Nocardiaceae,// genero //Rhodococcus//. Son bacilos Gram positivo, generalmente agrupaciones de formas bacilares las cuales pueden llegar a formar filamento vegetativo ramificado, septado y se fragmenta en formas bacilares y cocoidales, pudiendo producir formas celulares del tipo “L”, aerobios parcialmente acido alcohol resistente, no son moviles. El género Rhodococcus fue reestablecido por Tsukamura para acomodar a seis especies de Rhodococcus: //R. aurantiacus, R. bronchialis, R. rhodochrous, R. roseus, R. rubropertinctus y R. terrae// En la secuencia de DNA estudiada, encontramos un ORF que codifica para una proteína extracelular que forma parte de los receptores de R//hodococcus//. Imagen del analisis de la secuencia en la que se muestra el gen de la proteína elegida Estas proteinas son proteínas extracelulares de unión de Soluto a bacterias y sirven como quimiorreceptores, reconocimiento de los marcadores de los sistemas de transporte, y los iniciadores de vías de transducción de señales. Se encuentran más de 50 secuencias de unión a proteínas extracelulares de unión a bacterias Gram negativas.En las bacterias Gram-positivas que están rodeados por una sola membrana y, por consiguiente, no tienen region periplásmicas, la proteínas están vinculados a la membrana a través de una **N-terminal de lípidos ancla.** Qué significa esto??? En las bacterias Gram-positive se han analizado las similitudes de la secuencia, y se han determinado sus grados de parentesco, algunas de estas proteínas son homólogas a las proteínas citoplasmáticas, regulador transcripcional de bacteria. Estas proteínas homólogo no juegan un papel integral en el proceso de transporte de por sí, pero probablemente servir como los receptores para activar o iniciar la translocación de solutos a través de la membrana de unión a los sitios externos de la integración de las proteínas de la membrana del flujo de salida del sistema. Estas proteínas se clasifican en ocho grupos de la siguiente manera. Esta proteína tiene la siguiente estructura Estructura de la proteína de unión a soluto del genero Rhodococcus Una vez que conocemos la función de nuestra proteína, podemos decir que se trata de una proteína de membrana. Su estudio lo vamos a enfocar hacia un punto de vista de posible variación de la función (introduciendo una mutación) y a un punto de vista de su ubicación para poder emplear nuestro sistema de localización en otras proteínas de membrana. El código del ORF encontrado es el que a continuación se indica (en el programa se analizó la secuencia de DNA considerando un tamaño mínimo de los ORFs de 100 codones y usando como codones de inicio ATG y GTG): code [|_]extracellular solute-binding protein famil... [| 709]   0.0 code ||
 * // RESUMEN //**
 * // INTRODUCCIÓN //**
 * CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA EXTRACELULAR DE UNIÓN A SOLUTOS Del genero //Rhodococcus.// **
 * // 1- //****// INTRODUCCIÓN //**
 * Grupo 1-soluto proteínas de unión específicos para malto-oligosacáridos, varios oligosacáridos, glicerol 3-fosfato, y el hierro.
 * Grupo 2 son específicas para la galactosa, ribosa, arabinosa, monosacáridos y múltiples, y son homólogas a una serie de proteínas reguladoras transcripcionales incluida la lactosa, galactosa, fructosa y represores de E. coli.
 * Grupo 3, las proteínas son específicas para la histidina, lisina, arginina-ornitina, glutamina, octopina, nopalina, y aminoácidos básicos.
 * Grupo 4 estasproteínas son específicas para la leucina, isoleucina y leucina-valina, y son homólogas a las alifáticos amidase represor transcripcional, AMIC, de Pseudomonas aeruginosa.
 * Grupo 5 proteínas específicas para dipeptides y oligopéptidos, así como de níquel.
 * Grupo 6 las proteínas son específicas para el sulfato, tiosulfato, y posiblemente de fosfato.
 * Grupo 7 proteínas específicas para dicarboxylates y tricarboxylates, pero estas dos proteínas tienen una exposición insuficiente para establecer la similitud de secuencia de homología.
 * Grupo 8 proteínas son específicas para los complejos de hierro y, posiblemente, la vitamina B12
 * 04384491.1| ||

La secuencia de DNA que codifica para la proteína según este programa es la siguiente: 5´ATG CCCGACGATCTTCTACTTCCACGGCTACTGGAAGCTCGCCGAGGACGAGGCGTGGGTGATCGAGACCGAGGTCCCGAACTGCGAGTACTACAACTTCGTGTTGCAAAATTTCTGGGTGGAATCGCTCGACTACCACCGCTCGAACATCTACATCAACAACCACACCGCCAAGCTCAACGACGACGGGACCCTCACGATCGTCGTTGCGGCCAAGGACCCCGGTTACGGCAACTGGATCAGCACCGACGGCCACACCGAGGGCACGTGGGCAATGCGCTGGATCAAGGCCGACTCGCACCCGATCCCGACCGCCAAGGTCGTGAAGATCTGAGTCACAGCGCTTTCCGTACGGTCCGTCCGCGCCGCTCGTCGCGGACGGACCGTGCTCGTGAGTCGACCGATCCGACAACGGAGGACAACGTGCACAACCAGGCCTTCCGGCCCGCTCGACTGTTGGTGGGCGGCCTCACTGCGGTCGCCGTCCTGCTCGCGGGATGCGCGTCCGGGAACTCGGATGCCACCGCTGCGTCCACGTCCCCACGGCAGGCCGGTTTCGTGGGCGAGCAGCCAGACGACGCCGAACCCGCCGCCGGTGGCTCGCTCACCTTCGGGTCGTACTCGCTGCCGACCGTTCTCGACCCGGCACGGACCCAGGCCGCCGCCTCGACCGGCGGAACCGAGATGGCGGCAATCTACGACACCCTCCTCCGGCACGACTTCGACAGCCGAACATTCGTTCCACAGCTGGCGGAGACGTTCGAGGGCAGTGACGACCTCACGACCTACACCGTGACGTTGCGTCCCGGCACCCGTTTCAGCGACGGGAGCGTCCTCGATGCCGACGCCGTGAAGTGGAGTATCGAGCGCTTCGTGACGGCGAAAGGCGATGCATCCCAGACCTGGACGAACGTCGTCGACACTGTCGACACGCCGGACGAGTTGGCCGTCGTGTTCCGGCTGAAGCGGCCCTGGAGTGATTTCCCCGCCCTCCTCAGCCTGGGGCCGGGAATGATCGTCGGAGCCGGATCCGACACGGGCGGCACGTTCACCCCGGTCGGCGCAGGACCGTTCACGGTCACGAAGTTCGCGCCCCGCGAGGAGCTGCTGCTCTCCGCGCGTGCCGACTACGTGGGTGGGAAACCACTCTTGGACACATTGCGTTTCGTTCCGACGGCGGGCGCGCAGGCCCAGTACGAGTCAATGCGCAGCGGCCAGTTCGACATGACGTTCATCCTCCGCGACGAACGGGTCATCGATCAGGCACTGGCCGACGGGTACACCGGATTCCTCAGTCCGACCGGCCAGAACGGAATCGGCGTGATCAACAGCCGTCCGGGACGGCCGGGCGCGGATGTCCGGGTGCGCCAGGCCATCGCCTACGGTGTCGATCCCGAGGCGATCAATCAGCGCGCCAACGCAGGATTGGGCACCGCCAGCTCGGAACTCGTTCCCGAAGGTTCGCGGTGGTACAGCGGCGCCGAGGGACTCCGGTTCGACCCGGAACGGGCCCGAGAGCTGCTCGACGAGGCGAAGGCCGACGGCTTCGACGGGCGCATCTCGTATCTGACGACCCAGGATCCCGGCCAGCAGGCGACGGCGCTCACGGTCCAGGCGATGCTCCAGTCGATCGGGTTCGACGTCGCCGTCGACTATGCCACCGACACCACCGATCTGGTTCGAAAGGTCTACCGGGACCACGATTTCGATCTGACCCGGGGCGGCGCACCCATCGGGGAGGAAGCGCCGTTCCTGAACCTCTACGGCAGCATGGGAAGCGACTCCCGCAACAATGCAACGGGATTCGCCGATCCCGAGATGGATCGCCTGCTGCTCGCGGTGCAGACGGCTCCCACCGACGACGCCAAGCGGGATGCGATAGGTGACGTCCAGCGCTACGCGAACGAGACCGTGCCCTACGTGCTCTGGGGGCCGGCGGCCGTCCTGACCGCGTGGGAGCCGACGGTGCACGGCGTCAAGCGCACCGTCACCGACATCATGCTGTTCGACGACGCCTGGAAGTCCGGGCCCTGA 3´ En cuanto a la secuencia de aminoácidos que forman la proteína, se analizó su secuencia en el programas bioinformáticas NEBcutter.

PDDLLLPRLL EARRGRGVGD RDRGPELRVL QLRVAKFLGG IARLPPLEHL HQQPHRQAQR RRDPHDRRCG QGPRLRQLDQ HRRPHRGHVG NALDQGRLAP DPDRQGREDL SHSAFRTVRP RRSSRTDRAR ESTDPTTEDN VHNQAFRPAR LLVGGLTAVA VLLAGCASGN SDATAASTSP RQAGFVGEQP DDAEPAAGGS LTFGSYSLPT VLDPARTQAA ASTGGTEMAA IYDTLLRHDF DSRTFVPQLA ETFEGSDDLT TYTVTLRPGT RFSDGSVLDA DAVKWSIERF VTAKGDASQT WTNVVDTVDT PDELAVVFRL KRPWSDFPAL LSLGPGMIVG AGSDTGGTFT PVGAGPFTVT KFAPREELLL SARADYVGGK PLLDTLRFVP TAGAQAQYES MRSGQFDMTF ILRDERVIDQ ALADGYTGFL SPTGQNGIGV INSRPGRPGA DVRVRQAIAY GVDPEAINQR ANAGLGTASS ELVPEGSRWY SGAEGLRFDP ERARELLDEA KADGFDGRIS YLTTQDPGQQ ATALTVQAML QSIGFDVAVD YATDTTDLVR KVYRDHDFDL TRGGAPIGEE APFLNLYGSM GSDSRNNATG FADPEMDRLL LAVQTAPTDD AKRDAIGDVQ RYANETVPYV LWGPAAVLTA WEPTVHGVKR TVTDIMLFDD AWKSGP **// C-Terminal //** //__ Primers para amplificar la secuencia codificante de la proteína. __// A los primers en su extremo 5´ les añadimos una secuencia para que sea cortada por la enzima de restricción NdeI, y posteriormente será clonada en un vector que presente en su polilinker una secuencia de corte para NdeI. F D R G Q E Q F Q K A G G D P T I F Y F F1 S T G A K S S S R R P A V T R R S S T S F2 R P G P R A V P E G R R * P D D L L L P F3 1741 ttcgaccggggccaagagcagttccagaaggccggcggtgacccgacgatcttctacttc 1800 1741 aagctggccccggttctcgtcaaggtcttccggccgccactgggctgctagaagatgaag 1800 K S R P W S C N W F A P P S G V I K * K F6 R R G P G L A T G S P R R H G S S R R S F5 E V P A L L L E L L G A T V R R D E V E F4
 * //NETTcutter (448 aa.)//**
 * // N-Terminal //**
 * // DISEÑO DE PRIMERS PARA LA AMPLIFICACIÓN Y LA INTERRUPCIÓN GÉNICA //**

5´ GGAATTC CATATG (ATG) CCCGACGATCTTCTACTTC 3´ **//Primer directo//**

C S T T P G S P G P D P C R L R G T S G F1 V R R R L E V R A L T R A G C A G R A V F2 F D D A W K S G P * P V Q V A R D E R * F3 3781 tgttcgacgacgcctggaagtccgggccctgacccgtgcaggttgcgcgggacgagcggt 3840 3781 acaagctgctgcggaccttcaggcccgggactgggcacgtccaacgcgccctgctcgcca 3840 Q E V V G P L G P G S G H L N R P V L P F6 S N S S A Q F D P G Q G T C T A R S S R F5 T R R R R S T R A R V R A P Q A P R A T F4

//__ Primers para la interrupción de la secuencia codificante de la proteína __//**//. //** A uno de los primers en su extremo 5´ le añadimos una secuencia para que sea cortada por la enzima EcoRI, mientras que el otro primer lleva la secuencia reconocida por la enzima de restricción HindIII).
 * 5´ ** GGAATTC CATATG AGTCCCGGGCCTGAAGG ** 3´ ****// Primer reverso (en este primer no incluimos el codón de fin) //**

Primers mal diseñados, amplifican una secuencia muy pequeña

Uso del programa **//Primer3 Output//** (secuencia amplificada entre 200-400 nts) code 1 CCCGACGATCTTCTACTTCCACGGCTACTGGAAGCTCGCCGAGGACGAGGCGTGGGTGAT code

code 61 CGAGACCGAGGTCCCGAACTGCGAGTACTACAACTTCGTGTTGCAAAATTTCTGGGTGGA code

code 121 ATCGCTCGACTACCACCGCTCGAACATCTACATCAACAACCACACCGCCAAGCTCAACGA code

code 181 CGACGGGACCCTCACGATCGTCGTTGCGGCCAAGGACCCCGGTTACGGCAACTGGATCAG code

code 241 CACCGACGGCCACACCGAGGGCACGTGGGCAATGCGCTGGATCAAGGCCGACTCGCACCC code

code 301 GATCCCGACCGCCAAGGTCGTGAAGATCTGAGTCACAGCGCTTTCCGTACGGTCCGTCCG code

code 361 CGCCGCTCGTCGCGGACGGACCGTGCTCGTGAGTCGACCGATCCGACAACGGAGGACAAC code

code 421 GTGCACAACCAGGCCTTCCGGCCCGCTCGACTGTTGGTGGGCGGCCTCACTGCGGTCGCC code

code 481 GTCCTGCTCGCGGGATGCGCGTCCGGGAACTCGGATGCCACCGCTGCGTCCACGTCCCCA code

code 541 CGGCAGGCCGGTTTCGTGGGCGAGCAGCCAGACGACGCCGAACCCGCCGCCGGTGGCTCG code

code 601 CTCACCTTCGGGTCGTACTCGCTGCCGACCGTTCTCGACCCGGCACGGACCCAGGCCGCC code

code >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> code

code 661 GCCTCGACCGGCGGAACCGAGATGGCGGCAATCTACGACACCCTCCTCCGGCACGACTTC code

code 721 GACAGCCGAACATTCGTTCCACAGCTGGCGGAGACGTTCGAGGGCAGTGACGACCTCACG code

code 781 ACCTACACCGTGACGTTGCGTCCCGGCACCCGTTTCAGCGACGGGAGCGTCCTCGATGCC code

code <<<<<<<<< code

code 841 GACGCCGTGAAGTGGAGTATCGAGCGCTTCGTGACGGCGAAAGGCGATGCATCCCAGACC code

code 901 TGGACGAACGTCGTCGACACTGTCGACACGCCGGACGAGTTGGCCGTCGTGTTCCGGCTG code

code 961 AAGCGGCCCTGGAGTGATTTCCCCGCCCTCCTCAGCCTGGGGCCGGGAATGATCGTCGGA code

code 1021 GCCGGATCCGACACGGGCGGCACGTTCACCCCGGTCGGCGCAGGACCGTTCACGGTCACG code

code 1081 AAGTTCGCGCCCCGCGAGGAGCTGCTGCTCTCCGCGCGTGCCGACTACGTGGGTGGGAAA code

code 1141 CCACTCTTGGACACATTGCGTTTCGTTCCGACGGCGGGCGCGCAGGCCCAGTACGAGTCA code

code 1201 ATGCGCAGCGGCCAGTTCGACATGACGTTCATCCTCCGCGACGAACGGGTCATCGATCAG code

code 1261 GCACTGGCCGACGGGTACACCGGATTCCTCAGTCCGACCGGCCAGAACGGAATCGGCGTG code

code 1321 ATCAACAGCCGTCCGGGACGGCCGGGCGCGGATGTCCGGGTGCGCCAGGCCATCGCCTAC code

code 1381 GGTGTCGATCCCGAGGCGATCAATCAGCGCGCCAACGCAGGATTGGGCACCGCCAGCTCG code

code 1441 GAACTCGTTCCCGAAGGTTCGCGGTGGTACAGCGGCGCCGAGGGACTCCGGTTCGACCCG code

code 1501 GAACGGGCCCGAGAGCTGCTCGACGAGGCGAAGGCCGACGGCTTCGACGGGCGCATCTCG code

code 1561 TATCTGACGACCCAGGATCCCGGCCAGCAGGCGACGGCGCTCACGGTCCAGGCGATGCTC code

code 1621 CAGTCGATCGGGTTCGACGTCGCCGTCGACTATGCCACCGACACCACCGATCTGGTTCGA code

code 1681 AAGGTCTACCGGGACCACGATTTCGATCTGACCCGGGGCGGCGCACCCATCGGGGAGGAA code

code 1741 GCGCCGTTCCTGAACCTCTACGGCAGCATGGGAAGCGACTCCCGCAACAATGCAACGGGA code

code 1801 TTCGCCGATCCCGAGATGGATCGCCTGCTGCTCGCGGTGCAGACGGCTCCCACCGACGAC code

code 1861 GCCAAGCGGGATGCGATAGGTGACGTCCAGCGCTACGCGAACGAGACCGTGCCCTACGTG code

code 1921 CTCTGGGGGCCGGCGGCCGTCCTGACCGCGTGGGAGCCGACGGTGCACGGCGTCAAGCGC code

code 1981 ACCGTCACCGACATCATGCTGTTCGACGACGCCTGGAAGTCCGGGCCCTGA code code code
 * // Primer Directo //** 5´  CCG GAATTC CTCACCTTCGGGTCGTACTC 3´ (Con sitio de corte para EcoRI).

code code

code code
 * // Primer Reverso //** 5´ CCC AAGCTT GGTGTAGGTCGTGAGGTCGT 3´ (Con sitio de corte para HindIII).

Muchas proteínas extracelulares presentan en su secuencia de aminoácidos primaria un péptido líder. Este polipéptido, es una secuencia de aminoácidos presente en su extremo amino que sirve de señal para: a) El traslado del polipéptido del citoplasma al espacio periplasmático (en las células procariotas, b) la secreción del polipéptido, durante su síntesis, hacia el interior del retículo endoplásmico (en los organismos eucariotas). Se elimina de la proteína madura mediante enzimas específicas. Mediante el análisis bioinformático de la secuencia de aminoácidos de nuestra proteína, podremos prever si nuestra proteína se sintetiza tal y como se encuentra en la célula o se traduce y posteriormente sufre un procesamiento postraduccional, para eliminar el péptido líder del extremo N-terminal. Para ello utilizamos el programa informático SignalP 3.0 Server. code >Sequence             length = 70 code
 * //ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE PÉPTIDO LIDER EN NUESTRA PROTEÍNA.//**

code code
 * 1) Measure  Position  Value  Cutoff  signal peptide?

code max. C   25       0.548   0.52   YES code

code max. Y   36       0.499   0.32   YES code

code max. S    9       0.978   0.97   YES code

code mean S    1-35    0.641   0.51   YES code

code D    1-35    0.570   0.45   YES code

code code Lo primero que hemos hecho es ver donde se encuentra la proteina de union, utilizando el programa TMHMM, hemos obtenido lo siguiente: Sequence TMHMM2.0 outside 1 2034 Una de las proteínas de fusión que se emplea más en la actualidad es la denominada GFP o 'Green Fluorescent Protein' (proteína fluorescente verde). Proteína aislada de la medusa //Aequorea victoria// que tiene la propiedad de emitir luz verde cuando se la ilumina con luz ultravioleta o luz azul, sin necesidad de otras proteínas ni cofactores. El elemento emisor de luz o cromóforo es una estructura de tripéptido cíclico codificado en la secuencia primaria de la proteína. La proteína GFP y su utilización como proteína de fusión o proteína marcadora están patentadas y comercializadas por la empresa Clontech. Si introducimos nuestra proteína en el vector pGFPuv y éste en nuestro Rhodococcus, cuando se sintetice la proteina de unio a solutos (receptor) vamos a ver la localización de nuestra proteína mediante fluorescencia. De esta manera podemos saber si este método puede ser utilizado en otros microorganismos para la localización de proteínas de membrana. El plásmido que vamos a utilizar es el siguiente: pGFPuv. Nuestra proteína la introducimos en la parte 5´ MCS mediante //Hin//d III: 5´ MCS-ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TT G // (ATG) CCC GAC GAT CTT CTA-GGG CCC (TGA) //CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTA GAA AAA ATG AGT 3’ Los tripletes que están entre paréntesis son los de inicio y fin de nuestra proteína, por lo que al ir fusionada en este plásmido, habría que quitarlos. En rojo tenemos a nuestra proteína. Lo que tenemos en azul es //Hin//d III. El resto que está en negro es la secuencia de 5´ MCS. Una vez que tenemos el plásmido con nuestra proteína lo introducimos en nuestro microorganismo. Para la transformación una suspensión de bacterias y 10 µg del vector plasmídico se mezclaron suavemente en tubos Falcon e incubaron en hielo durante 30 min. Tras la adición de 500 µl de una solución de PEG [PEG 4000], la suspensión de bacterias se mezcló con cuidado e incubó a 20 ºC durante 20 min. A cada tubo se le añadieron 700 µl de medio de regeneración (Potato Dextrose Broth [PDB], Difco Laboratories, suplementado con 0.5 M de glucosa) y se incubó a 25 ºC durante 7 días. Alicuotas que contenían 300 µl de bacterias se sembraron en 10 ml de YCDA (0,1 % extracto de levadura, 0,1 % caseína hidrosilada, 0.5 M glucosa y 1,5% agar en una placa de petri de 9- cm) y se incubaron a 20 ºC en oscuridad durante 2 semanas. Una vez crecidas las colonias se obtuvieron las siguientes imágenes: En esta primera imagen vemos como unos colegas nuestros están con las bacterias fluorescentes. Placa de cultivo, con bacterias transformadas. **// BIBLIOGRAFÍA //** . SANCHEZ, N, SANDOVAL, AH, DIAZ-CORRALES, F //et al//. El género Rhodococcus. Una revisión didáctica. //Rev. Soc. Ven. Microbiol.// [online]. ene. 2004, vol.24, no.1-2 [citado 05 Julio 2009], p.24-33. Disponible en la World Wide Web: . ISSN 1315-2556. References Cho, W. J., Yoon, W. J., Moon, C. H., Cha, S. J., Song, H., Cho, H. R., et al. (2002). Molecular cloning of a novel chaperone-like protein induced by rhabdovirus infection with sequence similarity to the bacterial extracellular solute-binding protein family 5. // The Journal of Biological Chemistry, 277 // (44), 41489-41496. Heald, S. C., Brandao, P. F., Hardicre, R., & Bull, A. T. (2001). Physiology, biochemistry and taxonomy of deep-sea nitrile metabolising rhodococcus strains. //Antonie Van Leeuwenhoek, 80//(2), 169-183. Tam, R., & Saier, M. H.,Jr. (1993). Structural, functional, and evolutionary relationships among extracellular solute-binding receptors of bacteria. //Microbiological Reviews, 57//(2), 320-346.
 * 1) Most likely cleavage site between pos. 35 and 36: GGA-AG
 * USO DE OTROS PROGRAMAS BIOINFORMÁTICOS DE IDENTIFICACIÓN **
 * 1) Sequence Length: 2034
 * 2) Sequence Number of predicted TMHs: 0
 * 3) Sequence Exp number of AAs in TMHs: 0.1587400000000000000000000000001
 * 4) Sequence Exp number, first 60 AAs: 0.09688
 * 5) Sequence Total prob of N-in: 0.00605
 * // LOCALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA MEDIANTE LA FUSIÓN A LA PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE //**