Maria+Fernandez

María

El trabajo no se ha escrito tal como se pedía. Poca bibliografía.
 * 1) Microorganismo del cual procede la secuencia **.

El microorganismo del cual procede la secuencia pertenece al género Rhodococcus .(géneros en cursiva)


 * Reino Bacteria
 * Phylum Actinobacteria
 * Clase Actinobacteria
 * Subclase Actinobacteriae
 * Orden Actinomycetales
 * Suborden Corynebacterinae
 * Familia Nocardiaceae
 * Género Rhodococcus

** 2) Análisis informático de la secuencia. **

Los ORFs localizados por el programa ARTEMIS, en la secuencia de 17.000 pb, son los siguientes ;


 * · 133-618 Proteína hipotética
 * · 932-2002 Proteína de la familia de la alcohol deshidrogenasa (contiene Zn)
 * · 1772-4894 Proteína reguladora (TetR)
 * · 2003-3205 Proteína Acil CoA deshidrogenasa
 * · 3323-4942 Proteína CoA ligasa de ácidos grasos
 * · 4923-6878 Proteína CoA ligasa de ácidos grasos de cadena larga
 * · 7878-10313 Proteína hipotética de membrana
 * · 9506-10831 Componente que une ATP, de un transportador de resistencia a medicamentos tipo ABC
 * · 12960-14726 Proteína aldehído deshidrogenasa
 * · 14823-17000 Proteína receptora de un sistema de dos componentes



La proteína elegida para realizar el trabajo con ella es la aldehído deshidrogenasa, cuya secuencia se localiza entre los nucleótidos 12960-14726. la secuencia de la proteína es la siguiente ; (la secuencia de DNA que codifica la proteína elegida es:

En doble hélice ;

GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0

CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70

CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140

CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210

CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280

ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350

GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTACTA 486

La secuencia de aminoácidos es la siguiente (FASTA); MTEQLGRQSTSTSTDPKSDDHTFASLDPRNDSVVAQHPIADQQEIEKAVAAARTASKWWDQLGFQGRRKVLGNFRAAIATHAESMAAIISAETGKPSDDALLEVMLAVEHLDWAARNAQKVLRRRRVGAGLISANQSASVGYRPMGVVGVIGPWNYPLYTPMGSIGYALAAGNAVVFKPSELSPGVGVELARLWNIAAPGHPVLQTITGD GKTGALLCSSGVDKIAFTGSTATAKRVMAACADTLTPLVAECGGKDAMLVDSDANLDAAVSFAAFGAVGNGGQTCAGVERIYVAAPVYDAFLSKLTAALRDAHAGATDSSTYGPMTLGKQTAIVRGQIEDALSRGAKAVLGGLDSFNGPFIDPIILTDVPEDSTAITEETFGPSVVVNKVTDMNEGIERANASKYGLGASVFTKSSSKGR AIAEKLECGVVTVNSVLGFAGIAALPFGGVGDSGFGRIHGADGLREFSSVKSLAVQKFSAPLDLLTIERKARDMKISRWMLAKRHAKS

La peroxidación lipídica puede causar daños celulares irreparables, que si no se palian a tiempo inducen la apoptosis (Yang //et al.,// 2001). Algunos de los sistemas que sirver para proteger contra los productos que se generan por el estrés oxidativo son la aldehído deshidrogenasa, la alcohol deshidrogenasa, la aldo-ceto reductasa, las GPx dependientes de selenio y las GST (Hayes //et al.,// 2005). Hay varias Aldehído deshidrogenasa, se clasifican en función de si son dependientes de NAD+, NADP+ o ambos, (EC 1.2.1.3: Aldehído deshidrogenasa (NAD+) , EC 1.2.1.4: Aldehído deshidrogenasa (NADP+), EC 1.2.1.5: Aldehído deshidrogenasa (NAD(P)+)). Todas se encargan de oxidar un aldehído a un alcohol. En los microorganismos en los cuales se ha estudiado, forma parte de una ruta de síntesis de un osmoprotector, y es una enzima esencial para el crecimiento del microorganismo.

3 ) Análisis del gen que codifica para la proteína elegida.
 * diseño de primers para la amplificación del gen por PCR.

Se utilizó el programa Primer3Mangemer, la primera pareja de primers que ofrecía el programa fue la siguiente. No hay que utilizar programa. left --> ACTCTACTGCAAGCGCCACT Inicio en nt 794, longitud 20 pb, Tm 60.2 ºC , GC 55% right --> AGAGCTGTGGCCAGTACCAG Inicio en nt 945, longitud 20 pb, Tm 60.5 ºC, GC 60%

Está segura que esos primers amplifican el gen??

Para comprobar si el gen es esencial para la bacteria se puede clonar un fragmento interno del gen en un plásmido suicida, con el que después se transformaría al microorganismo. Una vez producida la recombinación entre el plásmido y la bacteria, en el genoma de la bacteria quedaría el gen incompleto, si la bacteria crece significa que el gen no es esencial, pero si no crece es porque se produjo una interrupción génica de un gen esencial. También se puede deleccionar un fragmento del gel por PCR, para los cuál se usaran 4 primer dos externos y dos internos ;
 * interrupción génica por PCR

GCCCGACCCCTCGACCG AACCACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0

CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70

CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTG GCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140

CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210

CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCC TGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280

ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350

GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCT GGGCGCTGCCTCCGTACTA 486

Primer 1 rojo Primer 2 azul Primer 3 rosa Primer 4 verde

Se produce una deleción de un fragmento interno del gen, como la secuencia seleccionada se encuentra en marco, la deleción no afecta al resto de genes que se localicen aguas abajo de este.

4 ) Análisis de la proteína elegida.  GCCCGACCCCTCGACCGAACC ACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0
 * diseño de primers para una rápida purificación mediante colas de histidina.

CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70

CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140

CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210

CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280

ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350

GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTAC TA 486


 * Primer 1 GCCCGACCCCTCGACCGAACC
 * Primer 2 CGCCGCCGCCGCCGCCGC CTCGAC ATCATGCCTCCGTCGCGGG (en morado está la cola de histidinas para una rápida purificación y en rosa está el sitio de corte para poder quitar las colas de histidina de la proteína una vez purificada). No se puede poner un sitio de corte de DNA para cortar una proteína. No lo ha entendido


 * estudio de la proteína por bioinformática

508 aminoácidos, pm = 53025.2, pI = 7.09 composición de aminoácidos Ala 14.4 % Arg 5.1 % Asn 2.8% Asp 5.9% Cys 1% Gln 2.8% Glu 4.1% Gly 10.2 % Hys 1.6% Ile 4.7 % Leu 7.9 % Lis 4.9% Met 2.2% Phe 3.3 % Pro 4.1 % Ser 8.1 % Thr 6.1 % Trp 1.2 % Tyr 1.6% Val 8.1%

No presenta coiled-coils, ni dominios transmembrana


 * mutagénesis in vitro <span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">(proqué ha elegido ese cambio????)

GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0

CGTGCCGTTC<span style="color: rgb(0, 255, 0);">GACCTCGACGTCG <span style="color: rgb(255, 0, 255);">AGC <span style="color: rgb(0, 255, 0);">GCGGCAAGGTCCG CGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAG<span style="color: rgb(255, 0, 0);">CTGGAGCTGCAGC <span style="color: rgb(255, 0, 255);">TCG <span style="color: rgb(255, 0, 0);">CGCCGTTCCAGGC GCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70

CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140

CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210

CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280

ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350

GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTACTA 486

El aminoácido que vamos a mutar en una serina ( marcado en rosa ) y lo vamos a cambiar por una arginina cuyo codón sería AGG, para ello vamos realizar la mutación en un plásmido, y sólo necesitaremos dos primers ; Primer 1 GACCTCGACGTCG AGG GCGGCAAGGTCCG <span style="color: rgb(255, 0, 0); font-size: 60%;"> Primer 2 CGGACCTTGCCGC  <span style="color: rgb(255, 0, 255); font-size: 12pt;">CCT <span style="font-size: 12pt; color: rgb(255, 0, 0);">CGACGTCGAGGTC


 * primers para fusionar la proteína con la GFP

<span style="color: rgb(255, 102, 0);"> GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCC TGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0

CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70

CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140

CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210

CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280

ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350

GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGAC<span style="color: rgb(255, 255, 0);">GGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCT<span style="color: rgb(255, 0, 255);">GGGCGCTGCCTCCGTACTA 486 <span style="color: rgb(255, 153, 0);"> Primer 1 <span style="font-family: Wingdings; color: rgb(255, 153, 0);"> <span style="color: rgb(255, 102, 0);">GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">Primer 2 <span style="color: rgb(255, 0, 255);">CCTTTACTCATATCATGCCTCCGTCGCGGG Primer 3 GGCATGATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG Primer 4 TTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG

=Bibliografía=

Hayes, J. D., Flanagan, J. U. y Jowsey, I. R. 2005. Glutathione transferases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 45: 51-88 Hayes, J. D., Flanagan, J. U. y Jowsey, I. R. 2005. Glutathione transferases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 45: 51-88

Yang, Y., Cheng, J. Z., Singhal, S. S., Saini, M., Pandya, U. et al.,. 2001. Role of glutathione Stransferases in protection against lipid peroxidation. Overexpression of hGSTA2-2 in K562 cells protects against hydrogen peroxide-induced apoptosis and inhibits JNK and caspase 3 activation. J Biol Chem 276: 19220-19230

Además de esta bibliografía se utilizaron los programas informáticos de las prácticas de la asignatura.