Ines+Dominguez

Ines Domínguez Pérez: Fragmento 6

Había que hacerlo en Wiki. Lo he convertido. Falta bibliografía y la escritura del trabajo. JAG.

**TRABAJO INGENIERÍA GENÉTICA** =Introducción=

Vamos a realizar el análisis de una secuencia de 17000pb de un microorganismo desconocido. Para ello lo primero vamos a utilizar programa informático ARTEMIS con el cual se hallan los distintos ORFs de nuestro fragmento y se realiza un análisis de la proteína a la cual más se parece. Una vez que hemos realizado este análisis elegiremos una proteína codificada por nuestro fragmento y realizaremos distintos análisis informáticos de dicha secuencia para conocer distintos datos de la proteína para la que codifica.

=Análisis de la secuencia de nucleótidos=

Tras realizar el análisis informático con el programa ARTEMIS se ve que la secuencia número 6 secuencia de nucleótidos tiene una gran semejanza con //Rhodococcus sp.//

Rhodococcus es una bacteria Gram positiva que se encuentra dentro de la agrupación de alto contenido en C+C (67%). En concreto dentro de este grupo de bacterias tiene la siguiente clasificación taxonómica: · Clase Actinobacteria · Subclase //Actinobacteridae// · Orden //Actinomycetales// · Suborden //Corynebarterineae// · Familia //Nocardiaceae// · Genero //Rhodococcus// =Análisis de la proteína=

Para este apartado del trabajo se realizarán todos los procedimientos utilizando como base la proteína 2-nitropropano dioxigenasa. Esta proteína participa en el metabolismo del nitrógeno y se encarga de realizar la siguiente reacción para la cual utiliza como cofactores los siguientes compuestos, [|FAD], hierro y [|FMN]. 2 2-nitropropano + O2 2 acetona + 2 nitrito Utilizando el programa informático EXPASY se han determinado las siguientes características de dicha proteína: 1. Secuencia de nucleótidos de la proteína

ATGGGCTACGTCTCCGACGCCAAGCTCACCGCGGCCACCGCCGCGGCGGGCGGTCTCGGGATCATCGCCGGCGGCATGCTGAGCTACGACGAACTCGAGCAGGCGATCCACTACGTCAAGGACCGGACCGACGCGTCCTTCGGTGTCAACCTGCGCGCCAATCAGGAAGACATCGACAAGCGACTCGATCTGCTGATCCGGTCCGGGGTCAAGGTGGCGTCGTTCGCGCTGGCCCCCAACCGGGACCTGATCGCGAAGCTCAAGGACGCCGGACTGGTGGTGGTGCCGTCGATCGGTGCCCGCCGGCACGCGGAGAAGGTCGCCGAGTGGGGCGTGGACGCCGTCGTCGTGCAGGGCGGCGAGGGCGGCGGCCACACCGGCGCCGTCCCGACCAGCCTGCTGCTGCCGCAGGTGGTCGACGCGGTCGACATCCCGGTGATCGCCGCGGGCGGGTACTTCGACGGCCGCGGCCTGGTCTCGGCCCTCGCGTACGGCGCCGACGGCATCGCGATGGGCACCCGCTTCATGCTGACCAGCGATTCCCCGGTGGCGCAGGCGGTCAAGGACGTCTACCTGTCGAAGTCGGTGAACGACACCGTCGTGACACTGGAGATCGACGGTGTGCCGCAGCGGGTGCTGCGCGCCGGCACGATCGACCAGCTCGAGTCCACCCGCGGACCCCAGCGCATGCTGAGAGCGCTGCGCAATGCCGTTGCGTTCCAGCGTCTGTCGGGAACGCCGTGGAAGGACATGATCCGCGAGGGGCTCGAGATGAAGAAGAGCCACGAACTCGGCTGGCGGCAGCTGGTCATGGCCGCGAACGCGCCGATGCTCTACCGGTCGGCGCTGGTCGACGGCAACGCAGACATCGGCGTGATGGCAACCGGGCAGGTGGTGGGCCTCATCGACGACGTCCCCAGCTGTGCCGAGCTGATCGACCGGATCGCGCACGAGGCGGAGTCCGTTCTGGACCGACTCGGCGGGGCCAACGAGCGCGTTTAG 2. Secuencia de aminoácidos Está mal. La proteína empieza antes. M G Y V S D A K L T A A T A A A G G L G I I A G G M L S Y D E L E Q A I H Y V K D R T D A S F G V N L R A N Q E D I D K R L D L L I R S G V K V A S F A L A P N R D L I A K L K D A G L V V V P S I G A R R H A E K V A E W G V D A V V V Q G G E G G G H T G A V P T S L L L P Q V V D A V D I P V I A A G G Y F D G R G L V S A L A Y G A D G I A M G T R F M L T S D S P V A Q A V K D V Y L S K S V N D T V V T L E I D G V P Q R V L R A G T I D Q L E S T R G P Q R M L R A L R N A V A F Q R L S G T P W K D M I R E G L E M K K S H E L G W R Q L V M A A N A P M L Y R S A L V D G N A D I G V M A T G Q V V G L I D D V P S C A E L I D R I A H E A E S V L D R L G G A N E R V

3. Peso molecular de 309961 4. Contenido en G+C de un 69% 5. Temperatura de anillamiento de 93 oC 6. Perfil de hidrofobicidad



7. Dominios transmembrana



8. Estructura terciaria de la proteína

Además también se ha realizado un análisis de la proteína comparando su secuencia con la de proteínas semejantes de organismos relacionados. Para ello utilizamos el programa informático MEGA.



Con el fin de saber si la proteína que utilizamos es esencial para dicho microorganismo realizaremos diferentes análisis mutagénicos para lo cual se requiere del uso de diferentes primers. __PRIMERS PARA AMPLIFICAR__ Requieren un sitio de corte para poder introducir en un plásmido suicida y que así se pueda expresar en una cepa de //E. coli//. En este caso vamos a introducir como sitio de restricción el de BamHI Primer 1: __GGATCC __ATGGGCTACGTCTCCG Tm= 60oC Primer 2: __GGATCC __CTAAACGCGCTCGTTGGC Tm= 61ºC

__PRIMERS PARA MUTAR__ A la hora de realizar un estudio de mutagénesis debemos saber que aminoácidos de la proteína se encuentran conservados ya que alguno de estos podría ser importante dentro de la secuencia proteica. Para ello realizamos un análisis con el programa informático de CLUSTAL.

[Clostridium ---MKKSIFSHMVGIKYPIIQGGMAWIADSSLAAAVSNAGGLGIITG- 44 [Klebsiella ---MQSNRVARILGIEKPVVQGPLSWLTDARLVAAVGNAGGLGVLGPNAGLTAATAVSTP 57 [Rhodococcus MTPTLKTALTELVGVEYPIVQTGMGWVSGPALTSATANAGGLGILASA 48 [Rhodococcus] ---MGYVSDAKLTAATAAAGGLGIIAGG 25 [Burkholderia -MALPAVLQNLALPVIASPMFIVSYPELVLAQCKAGIVGSFPALNARPAELLDEWL 55

[Clostridium NAPVEWVRQEIRKTKELTDKPFGVNIMLLAET---ADEIAQMVCDEGV KVVTTGAGNPG- 100 [Klebsiella EATAEKMREEIRKTKQLTEKPFGVNLIPTAENDIWTPAILPVIKEEGV KVVVYTGYGEGS 117 [Rhodococcus TMTYDELEHAIKKTKQLTDKPFGVNMRADATD---APQRADLLIREGV KVASFALAPKK- 104 [Rhodococcus] MLSYDELEQAIHYVKDRTDASFGVNLRANQED---IDKRLDLLIRSGV KVASFALAPNR- 81 [Burkholderia TQLQTQLAEHKAANPDAVIGPIAVNQIVHQSN-VRLEQDIRVCVEHKV PIFITSLRAPAR 114

[Clostridium ---KYIKKWKEHGIIVIP--VVPSVALAKRMEKSGADAIIAEGCESGGHVG--ELTTMTL 153 [Klebsiella LKPALFDELKAAGITIIYRDINPTPENSRRAEQAGADIIVATGFDEGGTLPGTALGTFTI 177 [Rhodococcus ---ELITKLKDHGIVVVP--SIGAAKHAVKVASWGADAVIVQGGEGGGHTG--GVATTLL 157 [Rhodococcus] ---DLIAKLKDAGLVVVP--SIGARRHAEKVAEWGVDAVVVQGGEGGGHTG--AVPTSLL 134 [Burkholderia ---EIVDAVHGYGGIVLH--DVINLRHAQKALEAGVDGLILVAAGAGGHAG--TTSPFAL 167 . : * :: : : . *.* :: . **. :** [Clostridium IPQVVDAVD-IPVIAAGGIGDGRGIAASFMLGADAVQVGTRFLVAKECTVHQNYKNKVMK 212 [Klebsiella VPLIVDAVQRVPVMAAGGITDARGARAVHALGAEGVFAGSVFISTIESRVPDSVKAKIVA 237 [Rhodococcus LPSVLDAVD-IPVIAGGGFFDGRGLAAALAYGAAGVAMGTRFLLTSDSSVPDSVKQEYLK 216 [Rhodococcus] LPQVVDAVD-IPVIAAGGYFDGRGLVSALAYGADGIAMGTRFMLTSDSPVAQAVKDVYLS 193 [Burkholderia VGEVRRIFD-GPIVLSGSIANGGSILAAQAMGADLAYMGTRFIATQEAHAVDAYKRAILE 226

[Clostridium AKDIDTQVTGRPTGHPVRIIRN---RLS 237 [Klebsiella ANGLDLRLFRTLP-DYYRALPG---KLS 261 [Rhodococcus RGLTDTTVSRKVDGMPHRVLNTDLVNSLEGSSYATGLIAAAKNATKFKAMTGMKWSTLAK 276 [Rhodococcus] KSVNDTVVTLEIDGVPQRVLRAGTIDQLESTRGPQRMLRALRNAVAFQRLSGTPWKDMIR 253 [Burkholderia AKSADIIYTNLFTGVHGNYIRES--IVN 252

[Clostridium RKFQILEKEGAPLEEFEKLGRG--ALSKAVIEGDIDNGSVMAGQIAGLINKEQTCSEIIN 295 [Klebsiella DTLVAMDRAGASKAELAQAMGGLRGMRLGMLEGNTDEGYISVGAGIGNIHAITSVAEVVN 321 [Rhodococcus DGLAMKRSGDRTLMQIIMAANTPMLLKAGLVEGNTEAGVLASGQVVGMINDLPSCKELIE 336 [Rhodococcus] EGLEMKKSHELGWRQLVMAANAPMLYRSALVDGNADIGVMATGQVVGLIDDVPSCAELID 313 [Burkholderia AGLDPDALPESDKTKMNFGGDK--AKAWKDIWGAGQGVGLMDDVPSVAELVA 302

[Clostridium EIFDEAYTLLDYK--- 308 [Klebsiella QLAV 325 [Rhodococcus NIMEDAAKRIDALAALR--- 353 [Rhodococcus] RIAHEAESVLDRLGGANERV 333 [Burkholderia RLKREYDDAKARLGIRA--- 319 .:

Por ejemplo vamos a realizar la mutación en la valina que se encuentra en la posición 70 y que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos GTC. Este es un aminoácido hidrofóbico y vamos a realizar una mutación para obtener un aminoácido hidrofílico como el aspártico (GAC). Primer 1: __GGATCC __ATGGGCTACGTCTCCG Tm=60oC Primer 2: CGGTCCGGGGACAAGGTGG Tm=60oC Primer 3: GCCACCTTGTCCCCGGACC Tm=60ºC Primer 4: __GGATCC __<span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTAAACGCGCTCGTTGGC Tm=61oC __PRIMERS PARA FUSIÓN CON GFP__ Este análisis se realiza para conocer la localización de la proteín o para realizar una determinación de la cantidad de proteína que se produce. Para ello se fusionará nuestra proteína con la proteína fluorescente verde (GFP) utilizando los siguientes primers. Primer 1: __<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GGATCC __<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">ATGGGCTACGTCTCCG Tm=60ºC Primer 2: <span style="background: blue none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">AGCGCGTTTAGATGAGTAAAGGAGAAGACC Tm=62 Primer 3: <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTTCTCCTTTACTCATAACGCGCTCG Tm=58 Primer 4: __<span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GGATCC __<span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG Tm=61ºC La proteína de fusión con GFP también se puede obtener utilizando el plásmido pGFPuv en el cual se clonará nuestra proteína.