Samuel+Alvarez


 * 1.- Microorganismo del cual procede la secuencia. **
 * **Situación taxonómica**

(ni una referencia citada, los nombres de especies o géneros deben ir en cursiva, cuatro referencias al final para cumplir ....) inicio de la proteína erróneo.


 *  Arbol filogenético de bacterias**: Nuestro microorganismo (que aparece como QUERY) se encuentra en la rama de //Rhodococcus//. Se trata, por tanto, y apoyándonos en comparación en la base de datos de PubMed, de un representante de este género. En estas bases de datos se nos indica que con un 81% de homología (una identidad de 1011 sobre 1247) el microorganismo que tenemos se asemeja a //Rhodococcus opacus//. Por lo tanto podemos decir que se trata de //Rhodococcus sp//.



2.- Análisis informático de la secuencia mediante el programa ARTEMIS **.


 * **Proteínas codificadas por la secuencia (ORFs)**
 * A continuación se especifican aquellos ORFs que contienen secuencias para proteínas conocidas o desconocidas, indicando la posición dentro del fragmento asignado. Se han obtenido a partir del análisis de los ORFs proporcionados por el programa ARTEMIS, utilizando la web del NCBI para realizar las pruebas de BLAST. **


 * 381-737: ** Gene for DnaA.
 * 412-1521: ** Proteína de iniciación de la replicación cromosómica.
 * 1089-1472: ** M. Smegmatis. Origino f replication and genes rpm,dnaA, dnaN, gnd, recF, gyrB and gyr A.
 * 2265-3275: ** DNA polymerase III Beta subunit.
 * 4269-4670: ** Putative 6-phosphoglunate dehydrogenase.
 * 4513-5475: ** DNA replication and repair protein RecF.
 * 5917-6528: ** Hypotetical protein RHA1_ro03670.
 * 6580-7284: ** Hypotetical protein ROP_34880.
 * 7515-8411: ** Phenoxybenzoate dioxygenase beta subunit.
 * 8819-9403: ** Putative hydrolase.
 * 9252-9593: ** Epoxide hydrolase.
 * 9715-10854: ** Gene for DNA gyrase beta subunit.
 * 12022-13122: ** DNA gyrase subunit A.
 * 14586-15662: ** Hypotetical protein.
 * 15763-16110: ** Multidrug resistant protein.


 * **Elección de una o varias proteínas interesantes de la secuencia**

Se encuentra entre la posición 2035 y la 3279 del fragmento que se me ha asignado.
 * Secuencia: DNA-directed __DNA polymerase III beta subunit__ Rhodococcus sp. ** Esta es la proteina que vamos a estudiar en profundida.

ATGCGCAGCCGTGTGCACTGCGGCCGCCGACCGTCCGCGCCTACCGAGAGGAACACCCGAGCG ATGGAGCTTGGAAGTATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGTCGCC TGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCTGCTG GGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCAGGTT CGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCTCGCC GACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCGGGTG CTCATCGCCTGCGGTAGCGCCAAGTTCTCCCTGCCCACGATGCCGGTCGAGGACTACCCG CAGCTGCCGACGCTGCCGCAGCAGACCGGTTCACTGCCGGTGGACCTGTTCTCCGAGGCC GTCAGCCAGGTCGCCGTCGCTGCCGGCAAGGACGACACCCTGCCGATGCTCACCGGCATC CGCGTCGAGATCGAGGGCACCGACGTCGTCCTCGCGGCCACCGACCGATTCCGCCTCGCG GTCCGCAAACTCGAGTGGATGCCCACCGCCGGCGACGTCACGGCCGCGGTGCTGGTGCCG GCCCGCACGCTGTCGGAGTCCGCGAAGACCCTCGGCGGCAACACTCTGGCCCCGGTCGAG CTGGCGCTCGGCGCCGGTGCGTCGGTCGGCACCGAGGGCATGCTCGGCATCGTCGCCGAC GGCCGTCGCACCACCACCCGCCTGCTCGACGCCGAGTTCCCCAAGTTCCGTCAGCTGCTG CCGGCCGAGCACACCGCGATGGCGACGGTGACGGTCGCCCCGCTGGTCGACGCGATCAAG CGTGTGGCTCTCGTCGCCGAGCGCGGTGCCCAGGTGCGGCTCGAGTTCAACAGCGAGGGT CTGGTCCTGTCCGCGGGCGGCGACGACGCCGGTCGGGCCGAGGAGGCGCTCGAGGCCGAT TTCCAGGGCGAGCCGCTGGTCATCGCGTTCAACCCCGGCTACCTCATCGACGGTCTCAAC TCGCTGCACTCCGAGCGTGTCACCTTCGGCTTCACCACCCCGAGCCGTCCCGCGGTGCTG CGTCCGGCCGGCGAGGAAGAGCTCGAGCGCGGCGAGTCCGGGACCTTCGCGGCCCCCGAG AGCGACTACATCTACCTGCTGATGCCGGTGCGGCTCCCGGGCTGATT


 * Secuencia en doble cadena: **

 ATGAGCGATGGAGCTTGGAAGTATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA

CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA

GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA CGACCCACGCCTGCTCGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCAGAGACGGGT

GGTTCGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT CCAAGCCCAGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA

CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC

GGTGCTCATCGCCTGCGGTAGCGCCAAGTTCTCCCTAA CCACGAGTAGCGGACGCCATCGCGGTTCAAGAGGGATT 

** RSRVHCGRRPSAPTERNTRA MELGSMKFRVAR EDFADSVAWVARSLPSRPPVPVLGGVLL GADEQGLTVSGFDYEVSAQVRVSAEVTTTGQVLVSGKLLADITRALPNKPVDVTVDGTRV LIACGSAKFSLPTMPVEDYPQLPTLPQQTGSLPVDLFSEAVSQVAVAAGKDDTLPMLTGI RVEIEGTDVVLAATDRFRLAVRKLEWMPTAGDVTAAVLVPARTLSESAKTLGGNTLAPVE LALGAGASVGTEGMLGIVADGRRTTTRLLDAEFPKFRQLLPAEHTAMATVTVAPLVDAIK RVALVAERGAQVRLEFNSEGLVLSAGGDDAGRAEEALEADFQGEPLVIAFNPGYLIDGLN SLHSERVTFGFTTPSRPAVLRPAGEEELERGESGTFAAPESDYIYLLMPVRLPG
 * Secuencia de amioácidos: La proteína empieza en MELGS....  porqué dice que la secuencia empieza después de un codon de fin.???


 * 3.- Análisis del gen que codifica para la/s proteína/s elegida/s **.


 * **Diseño de primers para la amplificación del gen/es por PCR**

LEFT PRIMER CGCAGCCGTGTGCACTGCGGCCGCCG

RIGHT PRIMER  AGTCGGGCCCTCGGCGTGGCCGTAGTCG


 * **Diseño de primers para amplificar fragmentos internos del gen/es y comprobar si dicho gen/es son esenciales o no para el microorganismo.**

__De 300 a 400 pb.__
<span style="color: rgb(0, 0, 0);">LEFT PRIMER AGCGATGGAGCTTGGAAG RIGHT PRIMER AGGGAGAACTTGGCGCTAC

Mediante RNA antisentido, <span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-size: 13.5pt;">aprobechando <span style="background-color: rgb(0, 255, 255); font-size: 13.5pt;">(ojo con las faltas de ortografía) los sistemas Dicer/Risc <span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-size: 13.5pt;">(no se pueen decir cosas como estas en un trabajo sin explicarlo o sin dar una referencia) de las bacterias podemos hacer una interrupción génica y comprobar si el gen es esencial para el microorganismo. Si esto no funciona se puede hacer mutación dirigida por PCR, deleccionando parte del gen y comprobar si crecen las bacterias que han hibridado.

<span style="font-family: Times,Verdana,Arial,sans-serif; font-size: 18px; line-height: normal;"> <span style="color: rgb(255, 0, 0);">ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA

CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA

GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGT <span style="color: rgb(0, 255, 0);">CTCTGCCCA <span style="color: rgb(0, 0, 0);">CGACCCACGCCTGCTCGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCA <span style="color: rgb(255, 0, 255);">GAGACGGGT <span style="color: rgb(0, 0, 0);"> <span style="color: rgb(0, 255, 0);">GGTTCGGG <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT <span style="color: rgb(255, 0, 255);">CCAAGCCC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">AGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA

CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC

GGTGCTCATCGCCTGCGGTAGCGCCAAGTTCTCCCTAA CCACGAGTAGCGGACGC <span style="color: rgb(0, 0, 255);">CATCGCGGTTCAAGAGGGATT <span style="color: rgb(0, 0, 0); font-family: monospace,Verdana,Arial,sans-serif; font-size: 18px; line-height: normal; white-space: pre;">

Primers Para realizar la delección de un fragmento para inactivar el producto génico. Los primers 1 y 4 son los elegidos por el programa de búsqueda de primers, mientras que el 2 y el 3 son primers diseñados a mano, complementarios, los cuales se encuentran en la parte central de la secuencia en la que se hará la delección. La secuencia seleccionada posee 336 pb en marco, por lo que la eliminación de esta no va a afectar al resto de genes que pueda haber aguas abajo del seleccionado, ni al codón de fin de este.

<span style="color: rgb(255, 0, 0);"> ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG Primer 1

CCCGAACCTGGGCAGAG Primer 2

CTCTGCCCAGGTTCGGG Primer 3

TTAGGGAGAACTTGGCGCTAC Primer 4


 * **Búsqueda informática de promotores.**

Promotores obtenidos con el [|PromScan].

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0); display: block; text-align: center;">Los promotores deben situarse en la secuencia
 * Score || Descripción del promotor. ||
 * 72 ||  || **Position:** || 61 ||
 * **Strand:** || - ||
 * **Sequence:** || ATCGCTCGGGTGTTCCT ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 72 ||  || **Position:** || 301 ||
 * **Strand:** || - ||
 * **Sequence:** || TCGGCGAGCAGCTTGCC ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 72 ||  || **Position:** || 712 ||
 * **Strand:** || - ||
 * **Sequence:** || GGGGCCAGAGTGTTGCC ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 72 ||  || **Position:** || 721 ||
 * **Strand:** || + ||
 * **Sequence:** || CTGGCCCCGGTCGAGCT ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 70 ||  || **Position:** || 299 ||
 * **Strand:** || + ||
 * **Sequence:** || CCGGCAAGCTGCTCGCC ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||



4.- Análisis de la/s proteína/s elegida/s ** <span style="color: rgb(255, 0, 0);"> Primers para mutación.

<span style="color: rgb(0, 255, 255);"> ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA
 * **Diseño de primers para amplificar los genes que codifican para la/s proteína/s de interés con colas de histidina para su rápida purificación.**

CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA

GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA <span style="color: rgb(0, 0, 0);">CGACCCACGCCTGCTCGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCA GAGACGGGT <span style="color: rgb(0, 0, 0);"> GGTTCGGG<span style="color: rgb(0, 0, 0);">TCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT CCAAGCCC AGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA

CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC

GGTGCTCATCGCC TGCG <span style="background-color: rgb(192, 192, 192); color: rgb(0, 0, 0);">GTAGCGCCAAGTTCT CCC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TAA CCACGAGTAGCGGACGC <span style="color: rgb(0, 0, 255);">CATCGCGGTTCAAGAGGG <span style="color: rgb(0, 0, 0);">A TT

<span style="color: rgb(0, 0, 0);">Primer 1: ACCGCTCGA <span style="color: rgb(255, 0, 0);">GAATTC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">ATG <span style="color: rgb(0, 255, 255);">AGCGATGGAGCTTGGAAG <span style="color: rgb(0, 0, 0);"> En rojo está el sitio de restricción.

Primer 2: ACCTGCGAC <span style="color: rgb(255, 0, 0);">CTCGAC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TTA <span style="color: rgb(0, 255, 0);">CGCCGCCGCCGCCGCCGC <span style="color: rgb(0, 0, 255);">GGGAGAACTTGGCGCTAC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">En rojo el sitio de restricción y en verde el TAG de 6 Histidinas.


 * **Estudio de la/s proteína/s por bioinformática.**

<span style="color: rgb(255, 0, 0);"> <span style="color: rgb(0, 0, 0); font-weight: normal;">Se trata de una proteina citoplasmática. Por tanto, no posee segmentos transmembrana ni secuencias de transporte. No se observan, por tanto, péptidos lider. code Número de amino ácidos de la proteina: 414

Peso molecular: 43822.0

PI teórico: 4.97 code <span style="color: rgb(0, 0, 0); font-family: arial,helvetica,sans-serif; font-weight: normal; line-height: 32px; white-space: normal;">

<span style="font-weight: normal; line-height: 32px; white-space: normal; font-family: arial,helvetica,sans-serif;">

<span style="font-family: arial,helvetica,sans-serif; font-size: small; line-height: 32px;">Composición de amino ácidos:

=
Ala (A) 49 11.8% Arg (R) 31 7.5% Asn (N) 6 1.4% Asp (D) 22 5.3% Cys (C) 2 0.5% Gln (Q) 10 2.4% Glu (E) 30 7.2% Gly (G) 37 8.9% His (H) 3 0.7% Ile (I) 9 2.2% Leu (L) 47 11.4% Lys (K) 9 2.2% Met (M) 8 1.9% Phe (F) 14 3.4% Pro (P) 29 7.0% Ser (S) 25 6.0% Thr (T) 32 7.7% Trp (W) 2 0.5% Tyr (Y) 5 1.2% Val (V) 44 10.6% Pyl (O) 0 0.0% Sec (U) 0 0.0% (B) 0 0.0% (Z) 0 0.0% (X) 0 0.0%======


 * **Mutagénesis in vitro del gen/es que codifican para la/s proteína/s elegida/s.**

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">Porqué ha elegido essa mutación? <span style="color: rgb(255, 0, 0);"> <span style="color: rgb(0, 0, 0);"><span style="color: rgb(255, 0, 0);">ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA

CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA

GCTGGGTGCGGACGAGCAGG  <span style="color: rgb(0, 0, 0); background-color: rgb(0, 255, 0);">GAC <span style="background-color: rgb(255, 255, 255);">TGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA CGACCCA CGCCTGCT CGTCC <span style="background-color: rgb(0, 255, 0);">CTG <span style="background-color: rgb(255, 255, 255);">ACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCAGAGACGGGT

GGTTCGGGTCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT CCAAGCCCAGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA

CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC

GGTGCTCATCGCCTGCGGTAGCGCCAAGTTCTCCCTAA CCACGAGTAGCGGACGC <span style="background-color: rgb(255, 255, 255); color: rgb(0, 0, 255);">CATCGCGGTTCAAGAGGGATT <span style="color: rgb(0, 0, 0);">

Primers para la mutación. En nuestro caso cambiamos Asp por Tyr.

<span style="color: rgb(0, 0, 0);"> ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG Primer 1

<span style="color: rgb(0, 0, 0);">GACGAGCAGG   <span style="color: rgb(0, 0, 0); background-color: rgb(0, 255, 0);">T <span style="background-color: rgb(0, 255, 0);">AC <span style="background-color: rgb(255, 255, 255);">TGACGGTCTCCGGC Primer 2

<span style="background-color: rgb(255, 255, 255);">CTGCTCGTCC <span style="background-color: rgb(0, 255, 0);">ATG <span style="background-color: rgb(255, 255, 255);">ACTGCCAGAGGCCG Primer 3 <span style="color: rgb(0, 0, 0);">

TTAGGGAGAACTTGGCGCTAC Primer 4 <span style="color: rgb(255, 0, 0);">


 * **Diseño de primers para realizar fusiones génicas entre la/s proteína/s de interés con la proteína fluorescente verde para estudiar su localización celular o su concentración a lo largo del crecimiento del microorganismo.**

<span style="color: rgb(0, 255, 255);">ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TATGAAGTTTCGCGTTGCTCGGGAGGACTTCGCCGACTCCGT TACTCGCTACCTCGAACCTTCATACTTCAAAGCGCAACGAGCCCTCCTGAAGCGGCTGAGGCA

CGCCTGGGTCGCGCGCAGCCTGCCGTCCCGGCCGCCCGTCCCCGTCCTCGGCGGTGTGCT GCGGACCCAGCGCGCGTCGGACGGCAGGGCCGGCGGGCAGGGGCAGGAGCCGCCACACGA

GCTGGGTGCGGACGAGCAGGGACTGACGGTCTCCGGCTTCGACTACGAGGTCTCTGCCCA <span style="color: rgb(0, 0, 0);">CGACCCACGCCTGCTCGTCCCTGACTGCCAGAGGCCGAAGCTGATGCTCCA GAGACGGGT <span style="color: rgb(0, 0, 0);"> GGTTCGGG<span style="color: rgb(0, 0, 0);">TCTCCGCGGAGGTCACGACCACCGGCCAGGTCCTGGTGTCCGGCAAGCTGCT CCAAGCCC AGAGGCGCCTCCAGTGCTGGTGGCCGGTCCAGGACCACAGGCCGTTCGACGA

CGCCGACATCACCCGCGCGCTGCCCAACAAGCCGGTCGACGTCACCGTGGACGGCACCCG GCGGCTGTAGTGGGCGCGCGACGGGTTGTTCGGCCAGCTGCAGTGGCACCTGCCGTGGGC

GGTGCTCATCGCC TGCG <span style="background-color: rgb(192, 192, 192); color: rgb(0, 0, 0);">GTAGCGCCAAGTTCT CCC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TAA CCACGAGTAGCGGACGC <span style="color: rgb(0, 0, 255);">CATCGCGGTTCAAGAGGG <span style="color: rgb(0, 0, 0);">A TT

<span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; font-size: 8pt;">

=
<span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; color: red; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; font-style: normal;">ATGAGTAAAGGAG AAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTT GAATTAGATGGTGATGTTAATG =====

=
<span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; color: red; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; font-style: normal;">TACTCATTTCCTC TTCTTGAAAAGTGACCTCAACAGGGTTAAGAACAACTTAATCTACCACTACAATTAC =====

TA<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTTGATATGTTTATT
__**Primers para realizar la fusión de las dos proteinas:**__

<span style="color: rgb(0, 0, 0);">Primer 1: 5’- <span style="color: rgb(0, 255, 255);"> ATGAGCGATGGAGCTTGGAAG

Primer 2: 5’-<span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; color: red; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTCCTTTACTCAT <span style="color: rgb(0, 0, 255);">GGGAGAACTTGGCGCTAC

Primer 3: 5’- <span style="background-color: rgb(192, 192, 192); color: rgb(0, 0, 0);">GTAGCGCCAAGTTCT CCC <span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; color: red; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">ATGAGTAAAGGAGAAG <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; color: red; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;"> Primer 4: 5’- <span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-size: 11pt; color: rgb(255, 0, 0);"> TTATTTGTATAGTTC


 * 5.- Escritura de un informe en castellano de la actividad realizada. **


 * RESUMEN:** <span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">(ni una referencia citada, los nombres de especies o géneros deben ir en cursiva, cuatro referencias al final para cumplir ....)


 * Rhodococcus es una bacteria aerobia, no esporulada e inmóvil perteneciente al grupo de las gram positivas. Se trata de un género cercano a Mycobacterium y Corynebacterium.Algunos son patógenos, pero la mayoría son inocuos y viven en numerosos hábitats.**
 * Se ha iniiciado el estudio del genoma de un representante de este género debido a que su importancia radica en la capacidad de otras especies para producir esteroides bioactivos, acrilamida y ácido acrílico. Además es importante en el proceso de degradación de productos contaminantes y la biodesulfuración de los combustibles fósiles.**
 * Se ha estudiado un fragmento del genoma de esta bacteria, eligiendo el gen de la subunidad beta de la DNA polimerasa III para hacer un análisis más específico de este. Lo que nos permite determinar numerosos parámetros del crecimiento y la replicación de esta cepa, como paso previo a estudios centrados en las enzimas metabólicas de este microorganismo.**
 * Hemos analizado la secuencia génica, así como la protéica, determinando sus características y comparándolas con bases de datos de microorganismos cercanos.**


 * INTRODUCCIÓN:**


 * La DNA** **polimerasa III es una holoenzima que participa en el proceso de replicación de DNA. Está formada por 10 péptidos diferentes, alcanzando un peso molecular superior a los 600 kd. Su función es la síntesis de la mayor parte del DNA en el proceso de replicación. También posee actividad correctora de copia 5´** à **3´ exonuucleasa.**


 * Está formada por 4 elementos diferentes: core polimerasa, subunidad beta y complejos g y t.**
 * El presente trabajo versa sobre el análisis y desarrollo de técnicas para el estudio de la subunidad beta de la DNA polimerasa III de //Rhoodococcus sp.,// la cual actúa formando un anillo u orquilla en torno a la doble hélice, fijando esta al core de la enzima.**


 * Se trata de un gen indispensable para el crecimiento del microorganismo, ya que sin ella no se puede realizar el grueso del proceso replicativo, al quedar inactivada la DNA polimerasa III.**


 * MATERIALES Y MÉTODOS:**


 * Para la obtención de la secuencia de DNA se han cultivado las cepas y aislado la molécula usando las instalaciones del departamento de Microbiología de la Universidad de León.Se ha empleado medio TSB o YEME líquido para crecer las bacterias en matraces.**


 * Tras aislar el DNA y crear con él una genoteca se han enviado los distintos fragmentos a la unidad de secuenciación de la Universidad de León.**


 * El análisis posterior se ha realizado mediante herramientas bioinformáticas, programas de tratamiento de secuencias genéticas y proteicas, bases de datos, etc. Estos aparecen referenciados en el cuerpo del trabajo cuando se ha considerado conveniente citarlos.**


 * RESULTADOS Y DISCUSIÓN:**


 * El resultado del estudio realizado es que la secuencia estudiada corresponde a un microorganismo del género //Rhoodococcus// el cual no se encuentra todavía en las bases de datos disponibles en Internet.**
 * Se trata de una secuencia de alto contenido en G+C, alrededor del 67%, lo que coincide con lo descrito en otras especies del mismo género.**


 * El fragmento estudiado posee numerosas ORFs, a partir de las cuales, mediante el BLAST en la base de datos de NCBI se ha podido determinar que una importante cantidad de las codificantes lo son para proteinas que tienen que ver con la replicación u otros procesos del DNA. Así podemos encontrar la DNA girasa, tanto las subunidad A como la beta. La proteína RecF, de replicación y reparación del DNA. Y la proteína que hemos elegido para el estudio, la Subunidad beta de la DNA polimerasa III. Por ello podemos decir, que aunque hay otras proteinas en la secuencia, esta parece ser un fragmento donde se concentran proteinas que actúan sobre el DNA.**


 * En cuanto a la secuencia elegida hemos diseñado primers para producir delecciones en ella. El resultado de este experimento, como no podía ser de otra forma, ha sido la completa ausencia de crecimiento de colonias.**
 * Hemos realizado mutaciones de un solo aminoácido para observar la respuesta en la funcionalidad de dicha proteína.**


 * También se han realizado un experimento de fusión de la proteína seleccionada con la proteína fluorescente verde (GFP), para observar la localización “in vivo” de nuestra proteína dentro del microorganismo. El resultado ha sido que esta aparece en el citoplasma, como predecían los estudios bioinformáticos previos y los conocimientos que ya existían sobre dicha proteína.**

== A la Universidad de León por cedernos sus instalaciones. Al Ministerio de Educación y Ciencia por concederme la beca de ayuda a estudios universitarios. Al Dr. José A. Gil por impartir la asignatura y enseñarnos los conocimientos necesarios para realizar el presente trabajo. Por último a mis compañeros de asignatura que en ocasiones me han ayudado con las dificultades que he tenido. ==

Interaction of the sliding clamp beta-subunit and Hda, a DnaA-related protein.
[|**Kurz M**], [|**Dalrymple B**], [|**Wijffels G**], [|**Kongsuwan K**]. CSIRO Livestock Industries, Queensland Bioscience Precinct, St. Lucia Queensland Dominion 4067, Australia.

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