Marco+Ricci

Trabajo Final

No ha escrito el trabajo con bibliografía. No referencias. No aparece la lista de proteínas codificadas por el fragmento de DNA, ni la secuencia de la proteína estudiada.

Key Words: Rhodococcus, arabynosiltransferasa.

 www.sciencedaily.com

Resumen: Rhodococcus sp. es un genero non-motil, aerobico, gram-positivo, filamentoso del phylum Actinobacteria. Estudio del gen que codifica para el enzima arabynosiltransferasa.Este microrganismo puede crecer en condiciones psicrofilas o mesofilas. Unas cepas de Rhodococcus tienen enzimas capaces de llevar a cabo reacciones muy importantes como la biodesulforilacion de combustibiles fossiles, la degradacion de polychlorinated biphenyls (PCBs), ademas tienen la capacidad de utilizar muchos compuestos organicos como fuente de energia. Es usado en la industria en la produccion de acrylammide y steroides bioactivos. Ultimamente ha sido empleado en EEUU para decontaminar aguas y suelos (bioremediacion).

Introduction: La arabinosiltransferasa es un enzyma implicado en la sintesis de la pared ya que actua en el proceso de sintesis del peptidoglucano. Es una proteina integral de membrana, su determinada actividad molecular es la de transferasa, transferendo grupos pentosiles. Es esencial para el desarollo de la pared celular.

Metodos y materiales: El aislamiento, el cultivo y la secuenciacion del genoma del microrganismo ha sido llevado a cabo por la Universidad de Leon, Departamento de Microbiologia. Por el analisis posterior de la proteina se han usado herramientas bioinformaticas.

Resultados:

Arbol Filogenetico del microrganismo



[|Secuencia completa]

Primers usados en este trabajo: Amplificacion del gen Forward primer: TCAACGCGATGTTCGTGC Reverse primer: AGCTGAGAAGAAACCAGCCTA

Primers for 1 (Entered)

 * These primers are for PCR**
 * **Forward-Primer** || || **Reverse-Primer** ||  ||
 * Length: || 18 || Length: || 21 ||
 * Percent GC: || 55 || Percent GC: || 47 ||
 * Tm: || 56 || Tm: || 52 ||
 * Self-Anneal: || 16 || Self-Anneal: || 14 ||
 * End-Anneal: || 8 || End-Anneal: || 12 ||
 * Offset: || 12 || Offset: || 3004 ||

Pair-Anneal: 10 Pair-End-Anneal: 8 Total valid primer pairs: 104


 * These primers will amplify a fragment of 2993 basepairs**
 * The sequence of DNA that will be amplified by these primers is**
 * 1 || ||
 * 51 || ||
 * 101 || ||
 * 151 || ||
 * 201 || ||
 * 251 || ||
 * 301 || ||
 * 351 || ||
 * 401 || ||
 * 451 || ||
 * 501 || ||
 * 551 || ||
 * 601 || ||
 * 651 || ||
 * 701 || ||
 * 751 || ||
 * 801 || ||
 * 851 || ||
 * 901 || ||
 * 951 || ||
 * 1001 || ||
 * 1051 || ||
 * 1101 || ||
 * 1151 || ||
 * 1201 || ||
 * 1251 || ||
 * 1301 || ||
 * 1351 || ||
 * 1401 || ||
 * 1451 || ||
 * 1501 || ||
 * 1551 || ||
 * 1601 || ||
 * 1651 || ||
 * 1701 || ||
 * 1751 || ||
 * 1801 || ||
 * 1851 || ||
 * 1901 || ||
 * 1951 || ||
 * 2001 || ||
 * 2051 || ||
 * 2101 || ||
 * 2151 || ||
 * 2201 || ||
 * 2251 || ||
 * 2301 || ||
 * 2351 || ||
 * 2401 || ||
 * 2451 || ||
 * 2501 || ||
 * 2551 || ||
 * 2601 || ||
 * 2651 || ||
 * 2701 || ||
 * 2751 || ||
 * 2801 || ||
 * 2851 || ||
 * 2901 || ||
 * 2951 || ||

Amplificacion fragmento interno (600-1560)

Forward primer: TTCGGCTGGTACTACGACGT Reverse primer: TTGATGCCGGACAACGACA

Primers for 1 (Entered)

 * These primers are for PCR**
 * **Forward-Primer** || || **Reverse-Primer** ||  ||
 * Length: || 20 || Length: || 19 ||
 * Percent GC: || 55 || Percent GC: || 52 ||
 * Tm: || 54 || Tm: || 57 ||
 * Self-Anneal: || 16 || Self-Anneal: || 16 ||
 * End-Anneal: || 12 || End-Anneal: || 6 ||
 * Offset: || 8 || Offset: || 951 ||

Pair-Anneal: 16 Pair-End-Anneal: 10 Total valid primer pairs: 50


 * These primers will amplify a fragment of 944 basepairs**
 * The sequence of DNA that will be amplified by these primers is**
 * 1 || ||
 * 51 || ||
 * 101 || ||
 * 151 || ||
 * 201 || ||
 * 251 || ||
 * 301 || ||
 * 351 || ||
 * 401 || ||
 * 451 || ||
 * 501 || ||
 * 551 || ||
 * 601 || ||
 * 651 || ||
 * 701 || ||
 * 751 || ||
 * 801 || ||
 * 851 || ||
 * 901 || ||

Busqueda informatica de promotores

code >GGACGCGCCCGTCAACGCGATGTTCGTGCGCGTGTCCAGCGAGTCCGTCGACGTCCTCAA Length of sequence-     2946 Threshold for promoters - 0.20 Number of predicted promoters -     2 Promoter Pos:   277 LDF-  0.57 -10 box at pos. 262 GGTCAAGCT Score   31 -35 box at pos. 242 TTCTCG   Score    27 Promoter Pos:  1324 LDF-  0.21 -10 box at pos. 1309 CTTCATGAT Score   40 -35 box at pos. 1290 TCGTCT   Score    11

code

Terminadores

1) 445 bp despues el inicio del primer promotor (TAA)

[|prom-term 1]

2)1315 bp despues el inicio del segundo promotor (TAG)

[|Prom-term 2]

Primers para amplificar el gen que codifica para la proteína de interés con colas de histidina para su rápida purificación. Las colas de histidina se encontran despues el codon de inicio (ATG) y antes del codon de stop (TAG)

Forward primer: ATGCATCATCACCATCACCAC Reverse primer: CTAGTGATGGTGGTGATGATG

Analisis Proteina

Hidrofobicidad

[|Hidrofobocidad1.pdf]



Dominios Conservados

Dominio conservado de pfam04602, Arabinose_trans, Mycobacterial cell wall arabinan synthesis protein.

[|Dominios conservados.htm]

Diseño de primers para realizar fusiones génicas entre la/s proteína/s de interés con la proteína fluorescente verde para estudiar su localización celular o su concentración a lo largo del crecimiento del microorganismo.

La proteina estudiata tendria que localizarse en la membrana con la presencia de unos peptidos liders. = =

References: Pubmed, Expasy, [|MicrobeWiki - MicrobeWiki],  www.sciencedaily.com.

AGRADECIMIENTOS:

A la Universidad de León por cedernos sus instalaciones. A la Università degli studi di Teramo por concederme la beca Erasmus. Al Dr. José A. Gil por impartir la asignatura y enseñarnos los conocimientos necesarios para realizar el presente trabajo. Por último a mis compañeros de asignatura que en ocasiones me han ayudado con las dificultades que he tenido.