Vanessa+Nicolas

Vanesa

Me lo mandó como documento word y lo metí en el wiki

Trabajo elaborado, no escrito en formato publicación, y sin bibliografía citada. Aparecen unas referencias al final. Porqué busca peptidos lider de una proteína que no va a ser secretada? Porqué hace alineamientos y arboles con Homo, Drosophila.....? Qué pasa cuando deleciona el gen o cuando lo muta? La proteina empieza en VIDLK.. y no en ARRQ. y  ** ESTUDIO DE LA PROTEÍNA SERIL T-RNA ** ** SINTETASA EN //Rhodococcus// **

Vanessa Nicolás García

Departamento Biología Molecular Facultad Ciencias ambientales y Biológicas León

Se ha realizado un estudio con un microorganismo del género //Rhodococcus//. Hemos elegido una de sus proteínas para analizar sus características y la del gen que la codifica. La proteína en cuestión es la seril t-RNA sintetasa. Para ello hemos hecho varios estudios bioinformáticas sobre las propiedades de la proteína conociendo así un poco más su función, localización y características fisico-químicas entre otras. Estudiando el gen hemos diseñado primers para hacer distintas mutaciones, amplificaciones, fusión de proteínas y adicción de colas de histidina para poder ver como afectan estas alteraciones a la funcionalidad de la proteína y también poder determinar su localización celular.
 * RESUMEN **

El género //Rhodococcus// pertenece a un grupo de microorganismos incluidos en el grupo de los actinomicetos nocardioformes, dentro de ellos en las bacterias que poseen ácidos micólicos en la pared celular. A este grupo pertenecen también los géneros //Gordona//, //Nocardia// y //Tsukamurella//. Dentro del género //Rhodococcus// encontramos descrita nueve especies. Es un género ampliamente distribuido por el medio ambiente. Entre otras localizaciones lo encontramos como patógeno del hombre y animales, actuando como microorganismos oportunistas causando infecciones. Son bacterias Gram positivas de forma bacilar y cocoidal, parcialmente alcohol-ácido resistentes y aeróbicas. Crecen bien a temperaturas de 30-37ºC. Son sensibles a lisozima. Trabajamos con una secuencia de 17.000 nucleótidos, en la cual buscamos los ORF que codifican para proteínas mediante el programa ARTEMIS y de todas ellas elegimos una(figura 1). La proteína estudiada es la enzima seril t-RNA sintetasa., su función es la adicción de serina en la síntesis de proteínas. Pertenece al grupo de las aminoacil t-RNA sintetasas, estas enzimas aceptan el aminoácido activado apropiado (en este caso la serina), interactúa con con el RNA mensajero y los ribosomas de tal forma que asegura que el aminoácido que transporta sea colocado correctamente en la secuencia de la cadena polipeptídica en crecimiento. Los aminoácidos son activados por la aminoacil t-RNA sintetasas por la reacción:
 * INTRODUCCION **

ATP + aminoácido1 + E1 ↔ aminoácido1-AMP-E1 + PPi A continuación el t-RNA específico para ese aminoácido debe aceptar el aminoácido activado según la reacción:

aminoácido1-AMP-E1 + t-RNA1 ↔ t-RNA1-aminoácido1 + AMP + E1 Las aminoacil t-RNA sintetasas deben de poseer al menos dos lugares de enlace, el primer lugar reconoce un aminoácido determinado y el segundo selecciona la molécula de t-RNA específico a la que el aminoácido debe unirse covalentemente.

Hemos hecho un estudio con el gen de la seril t-RNA sintetasa y con la proteína:

1. Análisis del gen de la seril t-RNA sintetasa: a) Diseño de primers para la amplificación del gen por PCR. b) Diseño de primers para amplificar un fragmento interno del gen.

2. Análisis de la proteína seril t_RNA sintetasa: a) Diseño de primers para amplificar el gen de la proteína con colas de histidina para su rápida purificación. b) Diseño de primers para la delección de un fragmento del gen de la proteína. c) Diseño de primers para la mutación de un nucleótido. d) Diseño de primers para realizar la fusión génica entre la seril t-RNA sintetasa y la proteína fluorescente verde para estudiar su localización celular o su concentración a lo largo del crecimiento del microorganismo.

Tenemos que realizar distintas PCR para analizar el gen, para ello usamos el plásmido pOJ260 de //E.coli// (figura 2), en el cual clonaremos el gen de la seril t-RNA sintetasa. Este plásmido es un plásmido suicida, es decir, no replica en //E.coli// porque lleva el origen de replicación de otra cepa pero sí puede integrarse en el cromosoma de //E. coli// por recombinación. Para poder clonar el DNA del gen en el plásmido tenemos que poner sitios de corte para algún enzima de restricción en los extremos 5´ de los primers, estos sitios de corte tienen que ser para enzimas de restricción que se encuentren dentro del sitio de clonación múltiple del plásmido. El plásmido lo introduciremos en células de //E.coli// para obtener los productos génicos de nuestro gen.
 * MATERIALES Y MÉTODOS **


 * TÉCNICA PCR:**

Es la Reacción en Cadena de la Polimerasa. Esta técnica es usada para la amplificación de un fragmento de DNA. Para ello necesitamos buffer de amplificación, primers, desoxinucleótidos trifosfato, Taq polimerasa, DNA molde y adyuvantes. La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos, cada uno de los cuales incluye tres pasos:
 * 1) Desnaturalización: necesitamos tener el DNA molde en forma de cadena sencilla, para ello le sometemos a temperaturas de 90-95ºC para romper los puentes de hidrógeno que rompen ambas cadenas. Le mantenemos a esta temperatura durante unos minutos para que desnaturalice completamente.
 * 2) Anillamiento: disminuimos la temperatura hasta 40-60ºC para que se puedan unir los primers al fragmento de DNA que queremos amplificar. La temperatura óptima de hibridación (Tm) es distinta para cada primer, pero debe ser similar para los primers usados en cada reacción.
 * 3) Extensión: se realiza a una temperatura de unos 70ºC. Se incorporan deoxinucleótidos en el extremo 3´ del primer usando como molde el fragmento de DNA que queremos amplificar.

Todo este proceso se realiza en un termociclador al cual le añadimos la mezcla de reacción y el DNA a amplificar. Usamos dos primers para realizar la amplificación, directo (complementario al extremo 3´ de la cadena codificante) y reverso (complementario al extremo 3´ de la cadena complementaria). En el extremo 5´ de los primers debemos añadir la secuencia de corte para un enzima de restricción que se encuentre en el polilinker del plásmido para poder clonar este gen en el plásmido.


 * ESTUDIO DEL GEN Y LA PROTEÍNA:**

a) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN POR PCR: Para ello realizamos una técnica de PCR en la cual utilizaremos dos primers flanqueantes al gen, directo y reverso. En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima BamHI. (ANEXO I).
 * 1) Análisis del gen de la seril t-RNA sintetasa:

b) DISEÑO DE PRIMERS PARA AMPLIFICAR UN FRAGMENTO INTERNO DEL GEN: Para realizar esta amplificación por PCR necesitamos diseñar primers internos al gen, para ello usamos el programa PRIMER 3, el cual nos da varios pares de primers con la probabilidad de cada uno de que sea el correcto, entre ellos elegimos una pareja. En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima XbaI. (ANEXO II). a) DISEÑO DE PRIMERS PARA AMPLIFICAR EL GEN DE LA PROTEÍNA CON COLAS DE HISTIDINA PARA SU RÁPIDA PURIFICACIÓN: Para ello hacemos una PCR utilizando dos primers flanqueantes al gen, directo y reverso. En el extremo 5´ del primer reverso añadimos 10-12 tripletes para el aminoácido histidina (codón histidina para //Rhodococcus// TAC)y a continuación el sitio de corte para el enzima de restricción. En el extremo 5´ del primer directo añadimos la secuencia de corte el enzima de restricción. En este caso añadimos los sitios de corte para la enzima BamHI. Una vez amplificada la proteína la purificamos en una columna de afinidad de Níquel que es muy específica para los residuos de histidina. Al pasar la preparación con la proteína unida a las colas de histidina quedará fuertemente unida a la columna. Posteriormente eluimos la proteína con imidazol para separarla de la columna, obtenemos la proteína unida a la cola de histidinas, a continuación añadimos una enzima (ej: enterocinasa) para eliminar la cola de histidina y así obtener la proteína pura. (ANEXO III)
 * 1) Análisis de la proteína seril t-RNA sintetasa:

b) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA DELECCIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE LA PROTEÍNA: Deleccionamos un fragmento interno del gen. Para ello hacemos una PCR usando cuatro primers, dos de ellos externos, igual a los usados en la amplificación del gen, y dos internos. Los internos deben flanquear al fragmento de DNA que queremos deleccionar. La secuencia de corte para el enzima de restricción debemos añadirla en los extremos 5´ de los primers externos, en este caso usamos la enzima SacII. (ANEXO IV).

c) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA MUTACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO: Realizamos la mutación de un nucleótido interno del gen. Para ello debemos hacer una PCR usando cuatro primers, dos de ellos externos y dos internos. Los primers externos se diseñan igual que para realizar la amplificación del gen. Los internos son complementarios entre sí, deben de llevar la misma secuencia que el gen y un nucleótido, el que queremos mutar, cambiado por el nuevo que queremos introducir. Al cambiar el nucleótido podemos cambiar el aminoácido para el que codifica, en este caso cambiamos el aminoácido glicina por valina, para ello mutamos el triplete GGC a GTC. El nucleótido que queremos mutar debe estar aproximadamente en el centro del primer. La secuencia de corte para el enzima de restricción debemos añadirla en los extremos 5´ de los primers externos, en este caso usamos la enzima BamHI. (ANEXO V).

d) DISEÑO DE PRIMERS PARA LA FUSIÓN GÉNICA ENTRE LA SERIL T-RNA SINTETASA Y LA PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE: Fusionamos el extremos carboxilo de nuestra proteína (Seril t-RNA sintetasa) al extremo amino de la proteína fluorescente verde (GFP). Para realizar la fusión hacemos una PCR usando también cuatro primers, dos para cada proteína. El primer 1 debe ser complementario al extremo 3´ de la cadena codificante de la seril t-RNA sintetasa. El primer 2 debe contener el extremo 5´ de la cadena codificante de la seril t-RNA sintetasa sin el últimos codón (codón STOP) y el extremo 3´ de la cadena codificante de la GFP. El primer 3 debe contener el extremo 3´ de la cadena complementaria de la seril t-RNA sintetasa eliminando el codón STOP y el extremo 5´ de la cadena complementaria de la GFP. El primer 4 debe contener el extremo 5´ de la cadena codificante de la GFP. Los sitios de corte para el enzima de restricción debemos añadirlos en los extremos 5´ de los primers 1 y 4, en este caso usamos la enzima EcoRI. (ANEXO VI).


 * PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE (GFP):**

La GFP se usa para fusionarla con la proteína que queremos estudiar y mediante la emisión de fluorescencia de la GFP poder localizar nuestra proteína. Esta proteína GFP fue aislada de la medusa //Aequorea victoria//. Emite luz verde cuando se la ilumina con luz UV gracias al cromóforo que posee que es una estructura de tripéptido cíclico en la secuencia primaria de la proteína, los 3 aminoácidos que forman el cromóforo son Ser65-Tyr66-Gly67. Es una proteína estable que contiene 238 aminoácidos. Esta enzima es un homodímero funcional con un dominio C-terminal característico de la clase II de las aminoacil t-RNA sintetasas y un dominio N-terminal implicado en la unión de los t-RNA (tabla 1). Pertenece a las llamadas proteínas coiled-coil (gráfico 1), esto es, que tienen dominios para unirse unas proteínas a otras polimerizándose. Esta característica es importante para la estabilidad de la enzima. Las características fisico-químicas se muestran en la tabla (tabla 2). Muestra diversos sitios de corte para distintas proteasas, en la tabla se muestran las proteasas que cortan, el número de cortes para cada una de ellas y el sitio específico de corte(tabla 3). La proteína no presenta péptido líder (gráfico 2), lo cual nos indica que es una proteína citoplasmática, ya que el péptido líder en una proteína es una secuencia de aminoácidos presente en su extremo amino que sirve de señal para excretar la proteína al exterior de la célula. Es una proteína citosólica, ya que según se muestra en la gráfica (gráfico 3) vemos que la probabilidad de poseer dominios transmembrana es menor que la probabilidad de que esté fuera de la membrana. Los aminoácidos conservados que presenta la seril t-RNA de //Rhodococcus// respecto a otros organismos los vemos en la tabla 4. El árbol filogenético de //Rhodococcus// se muestra en el gráfico 4.
 * RESULTADOS Y DISCUSIÓN **

En cuanto a los resultados obtenidos mediante las PCR: Tras la delección del fragmento interno del gen vemos que la proteína no es funcional, las proteínas sintetizadas a partir de la seril t-RNA sintetasa deleccionada no se traducen correctamente debido a que no incluyen el aminoácido serina, debido a esto, las bacterias que contienen la enzima deleccionada mueren. Por el contrario cuando sólo mutamos un aminoácido de la enzima las bacterias sobreviven, la enzima mantiene su funcionalidad aunque su estructura tridimensional es ligeramente distinta a la de la enzima silvestre. Con el experimento de fusión con la GFP podemos ver la localización de nuestra enzima iluminando las bacterias con luz UV, en este caso vemos una distribución más o menos homogénea de la proteína a través del citoplasma. El gen posee sitios de corte para varias enzimas de restricción que se muestran en el gráfico 5.


 * TABLAS Y GRÁFICOS **

figura 1

figura 2

code #HMM      *->MLDiKliReeKGGNpeaVkekLrkRgedlggdvldvdelleLDeeRRelqveleeLqaeRNelSKeIgkakkegdndedaeaLiaevkelkdeikaleaeLreleaelddllltiPNiP<-* code
 * Significant Pfam-A Matches   Show   or  hide   all alignments. ||
 * ** Original order ** || ** Pfam-A ** || ** Description ** || ** Entry type ** |||| ** Sequence ** |||| ** HMM ** || ** Bits score ** || ** E-value ** || ** Alignment mode ** || ** Predicted active sites ** || ||
 * ^  || ** Start ** || ** End ** ||^   ||^   || ** From ** || ** To ** ||^   ||^   ||^   ||^   ||^   ||
 * 0 || [|Seryl_tRNA_N] || Seryl-tRNA synthetase N-terminal domain || Domain || 11 || 116 || 1 || 119 || 130.5 || 5.3e-36 || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">ls ||  n/a  <span style="font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">  || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);"> ||
 * <span style="display: none; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">0 ||||||||||||||||||||||||

code <span style="color: rgb(64, 64, 64); display: none;">#MATCH        +D+K++Re    Np+aV+ ++r+Rg    +d+ +vd+lle D+ RR+++ + + L+ae+++ +K++g+a       e++ aL+a +kel +++k++ea+  e++a+ld++  +i Ni+ code

code <span style="color: rgb(64, 64, 64); display: none;">#SEQ         VIDLKFLRENPDAVRTSQRTRGEDPGLVDALLEADASRRAAILAGDTLRAEQKAFGKKVGQASP-EERPALLAGSKELAQKVKDAEAAQHEAQAKLDEAHRAISNIV    116 code ||^  ||
 * <span style="display: none; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">1 || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">[|tRNA-synt_2b] || <span style="font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">tRNA synthetase class II core domain (G, H, P, S and T) || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">Domain || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">180 || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">350 || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">1 || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">231 || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">208.0 || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">2.4e-59 || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">ls ||  n/a  <span style="font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);">  || <span style="display: block; text-align: center; font-size: 10pt; font-family: Verdana; color: rgb(64, 64, 64);"> ||

tabla 1

gráfico 1 code code
 * Number of amino acids:** 429

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 * Molecular weight:** 46955.9

code

code code
 * Theoretical pI:** 5.29

code code code
 * Amino acid composition:**

Ala (A) 51 11.9% code code Arg (R) 31      7.2% code

code Asn (N)  9      2.1% code

code Asp (D) 30      7.0% code

code Cys (C)  4      0.9% code

code Gln (Q) 21      4.9% code

code Glu (E) 31      7.2% code

code Gly (G) 38      8.9% code

code His (H)  9      2.1% code

code Ile (I) 13      3.0% code

code Leu (L) 42      9.8% code

code Lys (K) 17      4.0% code

code Met (M) 10      2.3% code

code Phe (F) 16      3.7% code

code Pro (P) 19      4.4% code

code Ser (S) 21      4.9% code

code Thr (T) 23      5.4% code

code Trp (W)  4      0.9% code

code Tyr (Y) 11      2.6% code

code Val (V) 29      6.8% code

code Pyl (O)  0      0.0% code

code Sec (U)  0      0.0% code

code code

code (B)  0         0.0% code

code (Z)  0         0.0% code

code (X)  0         0.0% code

code code

code code code

code code code
 * Total number of negatively charged residues (Asp + Glu):** 61

code code
 * Total number of positively charged residues (Arg + Lys):** 48

code code code code code
 * Atomic composition:**

code

code Carbon     C        2061 code

code Hydrogen   H        3257 code

code Nitrogen   N         591 code

code Oxygen     O         637 code

code Sulfur     S          14 code

code code code code code code
 * Formula:** C2061H3257N591O637S14
 * Total number of atoms:** 6560

code code code code code
 * Extinction coefficients:**

code

code Extinction coefficients are in units of M-1 cm-1, at 280 nm measured in water. code

code code code Ext. coefficient 38640 code code Abs 0.1% (=1 g/l)  0.823, assuming ALL Cys residues appear as half cystines code

code code code

code code

code

code Ext. coefficient   38390 code

code Abs 0.1% (=1 g/l)  0.818, assuming NO Cys residues appear as half cystines code

code code code

code code code
 * Estimated half-life:**

code code code The N-terminal of the sequence considered is A (Ala). code code

code

code The estimated half-life is: 4.4 hours (mammalian reticulocytes, in vitro). code

code >20 hours (yeast, in vivo). code

code >10 hours (Escherichia coli, in vivo). code

code code code

code code code
 * Instability index:**

code code code The instability index (II) is computed to be 31.80 code code This classifies the protein as stable. code

code code code

code code

code

code code
 * Aliphatic index:** 81.49

code code code code || tabla 2
 * Grand average of hydropathicity (GRAVY):** -0.336

**Nombre de la enzima** || **Nº de cortes** || **Posición de los sitios de corte** || Arg-C proteinase || 31 || 2 3 18 25 29 31 48 49 59 77 110 161 169 207 259 268 269 279 283 307 313 324 339 354 368 369 373 375 395 412 423 || || || Asp-N endopeptidase || 30 || 12 21 33 38 44 55 92 105 117 125 126 140 145 157 221 228 229 230 251 276 287 299 301 313 316 326 331 341 375 407 || || || Asp-N endopeptidase + N-terminal Glu || 61 || 12 18 21 32 33 38 42 44 55 60 74 75 85 92 94 99 105 106 117 124 125 126 131 135 140 142 145 148 151 157 159 208 221 222 228 229 230 238 248 251 269 276 287 290 298 299 301 303 311 313 316 326 331 341 343 354 375 376 401 407 423 || || || BNPS-Skatole || 4 || 263 311 346 396 || || || CNBr || 10 || 159 179 184 193 199 200 211 292 315 319 || || || Caspase1 || 1 || 45 || || || Chymotrypsin-high specificity (C-term to [FYW], not before P) || 31 || 8 16 65 128 140 142 170 171 172 176 197 216 225 233 245 260 263 267 274 287 293 295 311 323 341 346 353 365 374 396 420 || || || Chymotrypsin-low specificity (C-term to [FYWML], not before P) || 91 || 8 14 16 17 37 41 42 53 58 65 80 81 87 99 105 109 128 131 140 142 147 148 150 154 156 159 170 171 172 173 176 179 180 182 184 185 187 193 197 199 200 205 211 216 217 220 225 226 227 232 233 234 242 245 246 251 253 260 263 267 274 285 287 292 293 295 305 308 309 311 315 316 319 323 333 341 346 353 356 365 370 374 387 391 396 397 401 404 417 420 426 || || || Clostripain || 31 || 2 3 18 25 29 31 48 49 59 77 110 161 169 207 259 268 269 279 283 307 313 324 339 354 368 369 373 375 395 412 423 || || || Formic acid || 30 || 13 22 34 39 45 56 93 106 118 126 127 141 146 158 222 229 230 231 252 277 288 300 302 314 317 327 332 342 376 408 || || || Glutamyl endopeptidase || 31 || 19 33 43 61 75 76 86 95 100 107 125 132 136 143 149 152 160 209 223 239 249 270 291 299 304 312 344 355 377 402 424 || || || Hydroxylamine || 4 || 195 255 378 388 || || || Iodosobenzoic acid || 4 || 263 311 346 396 || || || LysC || 17 || 15 63 67 68 85 90 92 104 145 164 191 258 276 289 297 340 380 || || || LysN || 17 || 14 62 66 67 84 89 91 103 144 163 190 257 275 288 296 339 379 || || || NTCB (2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid) || 4 || 265 295 342 361 || || || Pepsin (pH1.3) || 113 || 7 8 13 14 15 16 16 37 40 41 41 42 52 53 57 58 64 80 80 81 86 104 105 127 128 130 131 140 141 148 150 153 154 155 156 170 170 172 172 173 175 176 179 180 181 182 184 185 186 187 196 197 205 215 216 216 217 224 225 226 227 231 232 232 233 233 234 241 244 245 250 251 252 253 262 263 266 267 273 274 286 292 293 294 295 308 308 310 311 316 321 322 332 333 340 345 352 353 355 364 365 374 386 387 390 391 396 396 400 401 416 419 426 || || || Pepsin (pH>2) || 90 || 7 8 13 14 15 16 16 37 40 41 41 42 52 53 57 58 64 80 80 81 86 104 105 127 128 130 131 140 141 148 150 153 154 155 156 170 172 172 173 175 176 179 180 181 182 184 185 186 187 196 197 205 215 216 216 217 226 227 231 232 233 234 241 250 251 252 253 266 267 286 292 293 308 308 316 321 332 333 340 355 386 387 390 391 396 400 401 416 419 426 || || || Proline-endopeptidase [*] || 4 || 78 208 298 381 || || || Proteinase K || 189 || 1 6 8 9 10 11 12 14 16 17 23 24 26 30 37 38 40 41 42 44 46 50 51 52 53 54 57 58 60 64 65 69 72 79 80 81 82 87 88 91 94 96 97 101 103 105 108 111 112 115 116 120 122 128 129 130 131 133 134 137 139 140 142 148 150 154 156 157 163 165 170 171 172 173 174 176 178 180 182 185 187 188 189 192 194 197 198 201 204 205 206 210 214 216 217 224 225 227 228 232 233 234 235 237 240 242 243 245 250 251 253 260 261 263 267 271 274 278 281 282 284 287 290 293 294 295 301 303 308 309 310 311 316 318 321 323 325 326 328 329 333 337 338 341 345 346 347 349 352 353 356 357 359 363 364 365 367 370 372 374 383 384 385 386 387 390 391 392 393 394 396 397 398 399 400 401 407 411 413 415 416 417 418 420 421 425 426 427 428 || || || Staphylococcal peptidase I || 30 || 19 33 43 61 75 86 95 100 107 125 132 136 143 149 152 160 209 223 239 249 270 291 299 304 312 344 355 377 402 424 || || || Thermolysin || 121 || 5 7 8 9 10 11 15 16 23 36 37 40 41 49 50 51 52 53 57 59 63 64 68 71 78 79 80 81 87 90 96 102 104 110 111 114 115 121 128 130 133 139 147 153 155 156 162 164 169 171 172 175 177 178 179 181 183 184 186 187 188 191 192 193 196 198 199 203 204 205 210 215 216 226 227 233 234 241 242 250 260 266 280 281 283 286 289 292 307 308 309 315 318 324 325 328 336 337 340 351 366 369 371 383 384 386 390 391 396 397 398 399 400 406 410 414 415 416 419 420 425 || || || Trypsin || 44 || 2 3 15 18 25 29 31 48 49 59 63 67 68 85 90 92 104 110 145 161 164 169 191 258 259 268 269 276 279 283 289 307 313 324 339 340 354 368 369 373 375 395 412 423 || tabla 3

gráfico 2

gráfico 3

tabla 4

gráfico 4


 * <span style="position: absolute; z-index: 2; margin-left: 74px; margin-top: 12px; width: 604px; height: 10px;">  [[image:file:///C:%5CDOCUME%7E1%5CJOSANT%7E1%5CCONFIG%7E1%5CTemp%5Cmsohtml1%5C01%5Cclip_image013.gif width="604" height="10"]] [[image:file:///C:%5CDOCUME%7E1%5CJOSANT%7E1%5CCONFIG%7E1%5CTemp%5Cmsohtml1%5C01%5Cclip_image014.gif width="740" height="34"]] ||
 * [[image:file:///C:%5CDOCUME%7E1%5CJOSANT%7E1%5CCONFIG%7E1%5CTemp%5Cmsohtml1%5C01%5Cclip_image015.gif width="740" height="16" link="javascript:;"]] ||
 * <span style="position: absolute; z-index: 1; margin-left: 87px; margin-top: 22px; width: 569px; height: 253px;">                                          [[image:file:///C:%5CDOCUME%7E1%5CJOSANT%7E1%5CCONFIG%7E1%5CTemp%5Cmsohtml1%5C01%5Cclip_image016.gif width="569" height="253"]] [[image:file:///C:%5CDOCUME%7E1%5CJOSANT%7E1%5CCONFIG%7E1%5CTemp%5Cmsohtml1%5C01%5Cclip_image017.gif width="740" height="281"]] ||

__ Display: __ || || - NEB single cutter restriction enzymes - Main non-overlapping, min. 100 aa ORFs || GC=69%, AT=31% ||

gráfico 5

** ANEXO i ** ** AMPLIFICACIÓN DEL GEN ** gcgcggcgtaaccaagtagggtttgtggtcgtgattgacctcaagttccttcgcgagaaccccgacgccgtccgcacctcgcagcgcacccgcggcgaagaccccggtctggtcgacgcgctgctcgaggccgatgcatcccgccgcgccgcgatcctggccggcgacacgctgcgcgccgagcagaaggcgttcggcaagaaggtggggcaggcctcacccgaggagcgtcccgcactgctcgccggctccaaggaactggcgcagaaggtgaaggacgccgaggccgcccagcacgaggcgcaggccaagctggacgaggcgcaccgcgcgatctccaacatcgtgcaggacggcgccccggccggcggcgaggacgacttcatcaccctcgagacggtcggcgagatcccgacgttcgacttcgagccgaaggaccacctcgagctcggtgagtcgctggggctgatcgacatggagcgcggcgccaaggtgtcgggctcgcggttctacttcctcaccggcttcggcgcgatgctccagctcggcatgctgcagctggcggcgcagaaggcgatggccaacggattcaccatgatgatcccgccggtgctggtgcgccccgaggtcatgcagggcaccggcttcctcggccagcactcggacgaggtctaccacctggccgacgacgacctgtacctcgtcggcacctccgaggtcccgctcgccggttaccactcgggcgagatcctcgacctgtcgaacggccccaagcggtacgcgggctggtcgtcgtgcttccgccgcgaggccggcagctacggcaaggacacgcgcggcatcatccgcgtccaccagttcgacaaggtggagatgttcacctactgcaagccggaggacgccgacgccgagcatcagcgcctgctcgcgtgggagcgcgacatgctcgacgcgatggggcttccgtaccgcgtcatcgacgtcgccggtggcgacctcggatcgtccgcggcccgcaagttcgactgcgaggcttgggttcccacgcagcaggcctaccgcgagctgacgtcgacgtcgaactgcaccacctaccaggcgcgccgcctgagcgtgcggtaccgcgacgagaacggcaagccgcagaccgcggcaaccctcaacggcaccctcgccaccacccgctggctcgttgcgatcctcgaaaaccaccagcaggcagacggttccgtgcgtgtcccggctgcactcgtgcccttcgtcgggcgtgaggtgctgacggcgccgtag ** DOBLE CADENA ** 5´ <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAGG GTTTGTGGTCGTGATTGACCTCAAGTTCCTTCGCGAGAAC 60 3´ CGCGCCGCATTGGTTCATCCCAAACACCAGCACTAACTGGAGTTCAAGGAAGCGCTCTTG 60 CCCGACGCCGTCCGCACCTCGCAGCGCACCCGCGGCGAAGACCCCGGTCTGGTCGACGCG 120 GGGCTGCGGCAGGCGTGGAGCGTCGCGTGGGCGCCGCTTCTGGGGCCAGACCAGCTGCGC 120 CTGCTCGAGGCCGATGCATCCCGCCGCGCCGCGATCCTGGCCGGCGACACGCTGCGCGCC 180 GACGAGCTCCGGCTACGTAGGGCGGCGCGGCGCTAGGACCGGCCGCTGTGCGACGCGCGG 180 GAGCAGAAGGCGTTCGGCAAGAAGGTGGGGCAGGCCTCACCCGAGGAGCGTCCCGCACTG 240 CTCGTCTTCCGCAAGCCGTTCTTCCACCCCGTCCGGAGTGGGCTCCTCGCAGGGCGTGAC 240 CTCGCCGGCTCCAAGGAACTGGCGCAGAAGGTGAAGGACGCCGAGGCCGCCCAGCACGAG 300 GAGCGGCCGAGGTTCCTTGACCGCGTCTTCCACTTCCTGCGGCTCCGGCGGGTCGTGCTC 300 GCGCAGGCCAAGCTGGACGAGGCGCACCGCGCGATCTCCAACATCGTGCAGGACGGCGCC 360 CGCGTCCGGTTCGACCTGCTCCGCGTGGCGCGCTAGAGGTTGTAGCACGTCCTGCCGCGG 360 CCGGCCGGCGGCGAGGACGACTTCATCACCCTCGAGACGGTCGGCGAGATCCCGACGTTC 420 GGCCGGCCGCCGCTCCTGCTGAAGTAGTGGGAGCTCTGCCAGCCGCTCTAGGGCTGCAAG 420 GACTTCGAGCCGAAGGACCACCTCGAGCTCGGTGAGTCGCTGGGGCTGATCGACATGGAG 480 CTGAAGCTCGGCTTCCTGGTGGAGCTCGAGCCACTCAGCGACCCCGACTAGCTGTACCTC 480 CGCGGCGCCAAGGTGTCGGGCTCGCGGTTCTACTTCCTCACCGGCTTCGGCGCGATGCTC 540 GCGCCGCGGTTCCACAGCCCGAGCGCCAAGATGAAGGAGTGGCCGAAGCCGCGCTACGAG 540 CAGCTCGGCATGCTGCAGCTGGCGGCGCAGAAGGCGATGGCCAACGGATTCACCATGATG 600 GTCGAGCCGTACGACGTCGACCGCCGCGTCTTCCGCTACCGGTTGCCTAAGTGGTACTAC 600 ATCCCGCCGGTGCTGGTGCGCCCCGAGGTCATGCAGGGCACCGGCTTCCTCGGCCAGCAC 660 TAGGGCGGCCACGACCACGCGGGGCTCCAGTACGTCCCGTGGCCGAAGGAGCCGGTCGTG 660 TCGGACGAGGTCTACCACCTGGCCGACGACGACCTGTACCTCGTCGGCACCTCCGAGGTC 720 AGCCTGCTCCAGATGGTGGACCGGCTGCTGCTGGACATGGAGCAGCCGTGGAGGCTCCAG 720 CCGCTCGCCGGTTACCACTCGGGCGAGATCCTCGACCTGTCGAACGGCCCCAAGCGGTAC 780 GGCGAGCGGCCAATGGTGAGCCCGCTCTAGGAGCTGGACAGCTTGCCGGGGTTCGCCATG 780 GCGGGCTGGTCGTCGTGCTTCCGCCGCGAGGCCGGCAGCTACGGCAAGGACACGCGCGGC 840 CGCCCGACCAGCAGCACGAAGGCGGCGCTCCGGCCGTCGATGCCGTTCCTGTGCGCGCCG 840 ATCATCCGCGTCCACCAGTTCGACAAGGTGGAGATGTTCACCTACTGCAAGCCGGAGGAC 900 TAGTAGGCGCAGGTGGTCAAGCTGTTCCACCTCTACAAGTGGATGACGTTCGGCCTCCTG 900 GCCGACGCCGAGCATCAGCGCCTGCTCGCGTGGGAGCGCGACATGCTCGACGCGATGGGG 960 CGGCTGCGGCTCGTAGTCGCGGACGAGCGCACCCTCGCGCTGTACGAGCTGCGCTACCCC 960 CTTCCGTACCGCGTCATCGACGTCGCCGGTGGCGACCTCGGATCGTCCGCGGCCCGCAAG 1020 GAAGGCATGGCGCAGTAGCTGCAGCGGCCACCGCTGGAGCCTAGCAGGCGCCGGGCGTTC 1020 TTCGACTGCGAGGCTTGGGTTCCCACGCAGCAGGCCTACCGCGAGCTGACGTCGACGTCG 1080 AAGCTGACGCTCCGAACCCAAGGGTGCGTCGTCCGGATGGCGCTCGACTGCAGCTGCAGC 1080 AACTGCACCACCTACCAGGCGCGCCGCCTGAGCGTGCGGTACCGCGACGAGAACGGCAAG 1140 TTGACGTGGTGGATGGTCCGCGCGGCGGACTCGCACGCCATGGCGCTGCTCTTGCCGTTC 1140 CCGCAGACCGCGGCAACCCTCAACGGCACCCTCGCCACCACCCGCTGGCTCGTTGCGATC 1200 GGCGTCTGGCGCCGTTGGGAGTTGCCGTGGGAGCGGTGGTGGGCGACCGAGCAACGCTAG 1200 CTCGAAAACCACCAGCAGGCAGACGGTTCCGTGCGTGTCCCGGCTGCACTCGTGCCCTTC 1260 GAGCTTTTGGTGGTCGTCCGTCTGCCAAGGCACGCACAGGGCCGACGTGAGCACGGGAAG 1260 GTCGGGCGTGAGGTGCTGACGGCGCCGTAG 3´ 1290 CAGCCCGCACT<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CCACGACTGCCGCGGCATC 5´ 1290 PRIMER DIRECTO: 5´ CGC GGATCC <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; font-family: "Courier New"; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAGG 3´ PRIMER REVERSO: 5´ CGC GGATCC <span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; font-family: "Courier New"; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTACGGCGCCGTCAGCACC 3´ SITIO DE CORTE BamHI : 5´ CGC GGATCC GCG 3´ code code code code
 * ANEXOS **

code code

code code
 * ANEXO II **

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code code

code code
 * AMPLIFICACIÓN FRAGMENTO INTERNO **

code code code

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code

code 1 GCGCGGCGTAACCAAGTAGGGTTTGTGGTCGTGATTGACCTCAAGTTCCTTCGCGAGAAC code

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code code 61 CCCGACGCCGTCCGCACCTCGCAGCGCACCCGCGGCGAAGACCCCGGTCTGGTCGACGCG code

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code code 121 CTGCTCGAGGCCGATGCATCCCGCCGCGCCGCGATCCTGGCCGGCGACACGCTGCGCGCC code

code code code

code code 181 GAGCAGAAGGCGTTCGGCAAGAAGGTGGGGCAGGCCTCACCCGAGGAGCGTCCCGCACTG code

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code code 241 CTCGCCGGCTCCAAGGAACTGGCGCAGAAGGTGAAGGACGCCGAGGCCGCCCAGCACGAG code

code code code

code code 301 GCGCAGGCCAAGCTGGACGAGGCGCACCGCGCGATCTCCAACATCGTGCAGGACGGCGCC code

code code code

code code 361 CCGGCCGGCGGCGAGGACGACTTCATCACCCTCGAGACGGTCGGCGAGATCCCGACGTTC code

code code code

code code 421 GACTTCGAGCCGAAGGACCACCTCGAGCTCGGTGAGTCGCTGGGGCTGATCGACATGGAG code

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code code 481 CGCGGCGCCAAGGTGTCGGGC<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TCGCGGTTCTACTTCCTCAC CGGCTTCGGCGCGATGCTC code

code <span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> code

code code code 541 CAGCTCGGCATGCTGCAGCTGGCGGCGCAGAAGGCGATGGCCAACGGATTCACCATGATG code code

code

code code code 601 ATCCCGCCGGTGCTGGTGCGCCCCGAGGTCATGCAGGGCACCGGCTTCCTCGGCCAGCAC code code

code

code code code 661 TCGGACGAGGTCTACCACCTGGCCGACGACGACCTGTACCTCGTCGGCACCTCCGAGGTC code code

code

code code code 721 CCGCTCGCCGGTTACCACTCGGGCGAGATCCTCGACCTGTCGAACGGCCCCAAGCGGTAC code code

code

code code code 781 GCGGGCTGGTCGTCGTGCTTCCGCCGCGAGGCCGGCAGCTACGGCAAGGACACGCGCGGC code code

code

code code code 841 ATCATCCGCGTCCACCAGTT<span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CGACAAGGTGGAGATGTTCA CCTACTGCAAGCCGGAGGAC code code <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;"><<<<<<<<<<<<<<<<<<<< code

code code code 901 GCCGACGCCGAGCATCAGCGCCTGCTCGCGTGGGAGCGCGACATGCTCGACGCGATGGGG code code

code

code code code 961 CTTCCGTACCGCGTCATCGACGTCGCCGGTGGCGACCTCGGATCGTCCGCGGCCCGCAAG code code

code

code code code 1021 TTCGACTGCGAGGCTTGGGTTCCCACGCAGCAGGCCTACCGCGAGCTGACGTCGACGTCG code code

code

code code code 1081 AACTGCACCACCTACCAGGCGCGCCGCCTGAGCGTGCGGTACCGCGACGAGAACGGCAAG code code

code

code code code 1141 CCGCAGACCGCGGCAACCCTCAACGGCACCCTCGCCACCACCCGCTGGCTCGTTGCGATC code code

code

code code code 1201 CTCGAAAACCACCAGCAGGCAGACGGTTCCGTGCGTGTCCCGGCTGCACTCGTGCCCTTC code code

code

code code code 1261 GTCGGGCGTGAGGTGCTGACGGCGCCGTAG code code

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code PRIMER DIRECTO: 5´ GC TCTAGA <span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TCGCGGTTCTACTTCCTCAC 3´ code code

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code code code PRIMER REVERSO: 5´ GC TCTAGA <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TGAACATCTCCACCTTGTCG 3´ code code

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code code code PUNTO CORTE XbaI: 5´ GC TCTAGA GC 3´ code code

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code code TAMAÑO AMPLIFICADO: 379

** ANEXO III ** ** AMPLIFICACIÓN CON COLAS DE HISTIDINA ** gcgcggcgtaaccaagtagggtttgtggtcgtgattgacctcaagttccttcgcgagaaccccgacgccgtccgcacctcgcagcgcacccgcggcgaagaccccggtctggtcgacgcgctgctcgaggccgatgcatcccgccgcgccgcgatcctggccggcgacacgctgcgcgccgagcagaaggcgttcggcaagaaggtggggcaggcctcacccgaggagcgtcccgcactgctcgccggctccaaggaactggcgcagaaggtgaaggacgccgaggccgcccagcacgaggcgcaggccaagctggacgaggcgcaccgcgcgatctccaacatcgtgcaggacggcgccccggccggcggcgaggacgacttcatcaccctcgagacggtcggcgagatcccgacgttcgacttcgagccgaaggaccacctcgagctcggtgagtcgctggggctgatcgacatggagcgcggcgccaaggtgtcgggctcgcggttctacttcctcaccggcttcggcgcgatgctccagctcggcatgctgcagctggcggcgcagaaggcgatggccaacggattcaccatgatgatcccgccggtgctggtgcgccccgaggtcatgcagggcaccggcttcctcggccagcactcggacgaggtctaccacctggccgacgacgacctgtacctcgtcggcacctccgaggtcccgctcgccggttaccactcgggcgagatcctcgacctgtcgaacggccccaagcggtacgcgggctggtcgtcgtgcttccgccgcgaggccggcagctacggcaaggacacgcgcggcatcatccgcgtccaccagttcgacaaggtggagatgttcacctactgcaagccggaggacgccgacgccgagcatcagcgcctgctcgcgtgggagcgcgacatgctcgacgcgatggggcttccgtaccgcgtcatcgacgtcgccggtggcgacctcggatcgtccgcggcccgcaagttcgactgcgaggcttgggttcccacgcagcaggcctaccgcgagctgacgtcgacgtcgaactgcaccacctaccaggcgcgccgcctgagcgtgcggtaccgcgacgagaacggcaagccgcagaccgcggcaaccctcaacggcaccctcgccaccacccgctggctcgttgcgatcctcgaaaaccaccagcaggcagacggttccgtgcgtgtcccggctgcactcgtgcccttcgtcgggcgtgaggtgctgacggcgccgtag ** DOBLE CADENA ** 5´ <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAGG GTTTGTGGTCGTGATTGACCTCAAGTTCCTTCGCGAGAAC 60 3´ CGCGCCGCATTGGTTCATCCCAAACACCAGCACTAACTGGAGTTCAAGGAAGCGCTCTTG 60 CCCGACGCCGTCCGCACCTCGCAGCGCACCCGCGGCGAAGACCCCGGTCTGGTCGACGCG 120 GGGCTGCGGCAGGCGTGGAGCGTCGCGTGGGCGCCGCTTCTGGGGCCAGACCAGCTGCGC 120 CTGCTCGAGGCCGATGCATCCCGCCGCGCCGCGATCCTGGCCGGCGACACGCTGCGCGCC 180 GACGAGCTCCGGCTACGTAGGGCGGCGCGGCGCTAGGACCGGCCGCTGTGCGACGCGCGG 180 GAGCAGAAGGCGTTCGGCAAGAAGGTGGGGCAGGCCTCACCCGAGGAGCGTCCCGCACTG 240 CTCGTCTTCCGCAAGCCGTTCTTCCACCCCGTCCGGAGTGGGCTCCTCGCAGGGCGTGAC 240 CTCGCCGGCTCCAAGGAACTGGCGCAGAAGGTGAAGGACGCCGAGGCCGCCCAGCACGAG 300 GAGCGGCCGAGGTTCCTTGACCGCGTCTTCCACTTCCTGCGGCTCCGGCGGGTCGTGCTC 300 GCGCAGGCCAAGCTGGACGAGGCGCACCGCGCGATCTCCAACATCGTGCAGGACGGCGCC 360 CGCGTCCGGTTCGACCTGCTCCGCGTGGCGCGCTAGAGGTTGTAGCACGTCCTGCCGCGG 360 CCGGCCGGCGGCGAGGACGACTTCATCACCCTCGAGACGGTCGGCGAGATCCCGACGTTC 420 GGCCGGCCGCCGCTCCTGCTGAAGTAGTGGGAGCTCTGCCAGCCGCTCTAGGGCTGCAAG 420 GACTTCGAGCCGAAGGACCACCTCGAGCTCGGTGAGTCGCTGGGGCTGATCGACATGGAG 480 CTGAAGCTCGGCTTCCTGGTGGAGCTCGAGCCACTCAGCGACCCCGACTAGCTGTACCTC 480 CGCGGCGCCAAGGTGTCGGGCTCGCGGTTCTACTTCCTCACCGGCTTCGGCGCGATGCTC 540 GCGCCGCGGTTCCACAGCCCGAGCGCCAAGATGAAGGAGTGGCCGAAGCCGCGCTACGAG 540 CAGCTCGGCATGCTGCAGCTGGCGGCGCAGAAGGCGATGGCCAACGGATTCACCATGATG 600 GTCGAGCCGTACGACGTCGACCGCCGCGTCTTCCGCTACCGGTTGCCTAAGTGGTACTAC 600 ATCCCGCCGGTGCTGGTGCGCCCCGAGGTCATGCAGGGCACCGGCTTCCTCGGCCAGCAC 660 TAGGGCGGCCACGACCACGCGGGGCTCCAGTACGTCCCGTGGCCGAAGGAGCCGGTCGTG 660 TCGGACGAGGTCTACCACCTGGCCGACGACGACCTGTACCTCGTCGGCACCTCCGAGGTC 720 AGCCTGCTCCAGATGGTGGACCGGCTGCTGCTGGACATGGAGCAGCCGTGGAGGCTCCAG 720 CCGCTCGCCGGTTACCACTCGGGCGAGATCCTCGACCTGTCGAACGGCCCCAAGCGGTAC 780 GGCGAGCGGCCAATGGTGAGCCCGCTCTAGGAGCTGGACAGCTTGCCGGGGTTCGCCATG 780 GCGGGCTGGTCGTCGTGCTTCCGCCGCGAGGCCGGCAGCTACGGCAAGGACACGCGCGGC 840 CGCCCGACCAGCAGCACGAAGGCGGCGCTCCGGCCGTCGATGCCGTTCCTGTGCGCGCCG 840 ATCATCCGCGTCCACCAGTTCGACAAGGTGGAGATGTTCACCTACTGCAAGCCGGAGGAC 900 TAGTAGGCGCAGGTGGTCAAGCTGTTCCACCTCTACAAGTGGATGACGTTCGGCCTCCTG 900 GCCGACGCCGAGCATCAGCGCCTGCTCGCGTGGGAGCGCGACATGCTCGACGCGATGGGG 960 CGGCTGCGGCTCGTAGTCGCGGACGAGCGCACCCTCGCGCTGTACGAGCTGCGCTACCCC 960 CTTCCGTACCGCGTCATCGACGTCGCCGGTGGCGACCTCGGATCGTCCGCGGCCCGCAAG 1020 GAAGGCATGGCGCAGTAGCTGCAGCGGCCACCGCTGGAGCCTAGCAGGCGCCGGGCGTTC 1020 TTCGACTGCGAGGCTTGGGTTCCCACGCAGCAGGCCTACCGCGAGCTGACGTCGACGTCG 1080 AAGCTGACGCTCCGAACCCAAGGGTGCGTCGTCCGGATGGCGCTCGACTGCAGCTGCAGC 1080 AACTGCACCACCTACCAGGCGCGCCGCCTGAGCGTGCGGTACCGCGACGAGAACGGCAAG 1140 TTGACGTGGTGGATGGTCCGCGCGGCGGACTCGCACGCCATGGCGCTGCTCTTGCCGTTC 1140 CCGCAGACCGCGGCAACCCTCAACGGCACCCTCGCCACCACCCGCTGGCTCGTTGCGATC 1200 GGCGTCTGGCGCCGTTGGGAGTTGCCGTGGGAGCGGTGGTGGGCGACCGAGCAACGCTAG 1200 CTCGAAAACCACCAGCAGGCAGACGGTTCCGTGCGTGTCCCGGCTGCACTCGTGCCCTTC 1260 GAGCTTTTGGTGGTCGTCCGTCTGCCAAGGCACGCACAGGGCCGACGTGAGCACGGGAAG 1260 GTCGGGCGTGAGGTGCTGACGGCGCCGTAG 3´ 1290 CAGCCCGCACT<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CCACGACTGCCGCGGC ATC 5´ 1290 PRIMER DIRECTO: 5´ CGC GGATCC <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; font-family: "Courier New"; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAGG 3´ PRIMER REVERSO: 5´ CGC GGATCC  <span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; font-family: "Courier New"; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TACTACTACTACTACTACTACTACTACTAC <span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; font-family: "Courier New"; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CGGCGCCGTCAGCACC 3´ SITIO DE CORTE BamHI : 5´ CGC GGATCC GCG 3´ CODÓN HISTIDINA PARA //Rhodococcus//: <span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TAC

** ANEXO IV ** ** DELECCIÓN DEL GEN ** gcgcggcgtaaccaagtagggtttgtggtcgtgattgacctcaagttccttcgcgagaaccccgacgccgtccgcacctcgcagcgcacccgcggcgaagaccccggtctggtcgacgcgctgctcgaggccgatgcatcccgccgcgccgcgatcctggccggcgacacgctgcgcgccgagcagaaggcgttcggcaagaaggtggggcaggcctcacccgaggagcgtcccgcactgctcgccggctccaaggaactggcgcagaaggtgaaggacgccgaggccgcccagcacgaggcgcaggccaagctggacgaggcgcaccgcgcgatctccaacatcgtgcaggacggcgccccggccggcggcgaggacgacttcatcaccctcgagacggtcggcgagatcccgacgttcgacttcgagccgaaggaccacctcgagctcggtgagtcgctggggctgatcgacatggagcgcggcgccaaggtgtcgggctcgcggttctacttcctcaccggcttcggcgcgatgctccagctcggcatgctgcagctggcggcgcagaaggcgatggccaacggattcaccatgatgatcccgccggtgctggtgcgccccgaggtcatgcagggcaccggcttcctcggccagcactcggacgaggtctaccacctggccgacgacgacctgtacctcgtcggcacctccgaggtcccgctcgccggttaccactcgggcgagatcctcgacctgtcgaacggccccaagcggtacgcgggctggtcgtcgtgcttccgccgcgaggccggcagctacggcaaggacacgcgcggcatcatccgcgtccaccagttcgacaaggtggagatgttcacctactgcaagccggaggacgccgacgccgagcatcagcgcctgctcgcgtgggagcgcgacatgctcgacgcgatggggcttccgtaccgcgtcatcgacgtcgccggtggcgacctcggatcgtccgcggcccgcaagttcgactgcgaggcttgggttcccacgcagcaggcctaccgcgagctgacgtcgacgtcgaactgcaccacctaccaggcgcgccgcctgagcgtgcggtaccgcgacgagaacggcaagccgcagaccgcggcaaccctcaacggcaccctcgccaccacccgctggctcgttgcgatcctcgaaaaccaccagcaggcagacggttccgtgcgtgtcccggctgcactcgtgcccttcgtcgggcgtgaggtgctgacggcgccgtag 5´ <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAG GGTTTGTGGTCGTGATTGACCTCAAGTTCCTTCGCGAGAAC 60 3´ CGCGCCGCATTGGTTCATCCCAAACACCAGCACTAACTGGAGTTCAAGGAAGCGCTCTTG 60 CCCGACGCCGTCCGCACCTCGCAGCGCACCCGCGGCGAAGACCCCGGTCTGGTCGACGCG 120 GGGCTGCGGCAGGCGTGGAGCGTCGCGTGGGCGCCGCTTCTGGGGCCAGACCAGCTGCGC 120 CTGCTCGAGGCCGATGCATCCCGCCGCGCCGCGATCCTGGCCGGCGACACGCTGCGCGCC 180 GACGAGCTCCGGCTACGTAGGGCGGCGCGGCGCTAGGACCGGCCGCTGTGCGACGCGCGG 180 GAGCAGAAGGCGTTCGGCAAGAAGGTGGGGCAGGCCTCACCCGAGGAGCGTCCCGCACTG 240 CTCGTCTTCCGCAAGCCGTTCTTCCACCCCGTCCGGAGTGGGCTCCTCGCAGGGCGTGAC 240 CTCGCCGGCTCCAAGGAACTGGCGCAGAAGGTGAAGGACGCCGAGGCCGCCCAGCACGAG 300 GAGCGGCCGAGGTTCCTTGACCGCGTCTTCCACTTCCTGCGGCTCCGGCGGGTCGTGCTC 300 GCGCAGGCCAAGCTGGACGAGGCGCACCGCGCGATCTCCAACAT<span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CGTGCAGGACGGCGCC 3´ 360 CGCGTCCGGTTCGACCTGCTCCGCGTGGCGCGCTAGAGGTTGTA<span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCACGTCCTGCCGCGG 5´ 360 CCGGCCGGCGGCGAGGACGACTTCATCACCCTCGAGACGGTCGGCGAGATCCCGACGTTC 420 GGCCGGCCGCCGCTCCTGCTGAAGTAGTGGGAGCTCTGCCAGCCGCTCTAGGGCTGCAAG 420 GACTTCGAGCCGAAGGACCACCTCGAGCTCGGTGAGTCGCTGGGGCTGATCGACATGGAG 480 CTGAAGCTCGGCTTCCTGGTGGAGCTCGAGCCACTCAGCGACCCCGACTAGCTGTACCTC 480 CGCGGCGCCAAGGTGTCGGGCTCGCGGTTCTACTTCCTCACCGGCTTCGGCGCGATGCTC 540 GCGCCGCGGTTCCACAGCCCGAGCGCCAAGATGAAGGAGTGGCCGAAGCCGCGCTACGAG 540 CAGCTCGGCATGCTGCAGCTGGCGGCGCAGAAGGCGATGGCCAACGGATTCACCATGATG 600 GTCGAGCCGTACGACGTCGACCGCCGCGTCTTCCGCTACCGGTTGCCTAAGTGGTACTAC 600 ATCCCGCCGGTGCTGGTGCGCCCCGAGGTCATGCAGGGCACCGGCTTCCTCGGCCAGCAC 660 TAGGGCGGCCACGACCACGCGGGGCTCCAGTACGTCCCGTGGCCGAAGGAGCCGGTCGTG 660 TCGGACGAGGTCTACCACCTGGCCGACGACGACCTGTACCTCGTCGGCACCTCCGAGGTC 720 AGCCTGCTCCAGATGGTGGACCGGCTGCTGCTGGACATGGAGCAGCCGTGGAGGCTCCAG 720 CCGCTCGCCGGTTACCACTCGGGCGAGATCCTCGACCTGTCGAACGGCCCCAAGCGGTAC 780 GGCGAGCGGCCAATGGTGAGCCCGCTCTAGGAGCTGGACAGCTTGCCGGGGTTCGCCATG 780 5´ <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGGGCTGGTCGTCGTGC TTCCGCCGCGAGGCCGGCAGCTACGGCAAGGACACGCGCGGC 840 3´ <span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CGCCCGACCAGCAGCACG AAGGCGGCGCTCCGGCCGTCGATGCCGTTCCTGTGCGCGCCG 840 ATCATCCGCGTCCACCAGTTCGACAAGGTGGAGATGTTCACCTACTGCAAGCCGGAGGAC 900 TAGTAGGCGCAGGTGGTCAAGCTGTTCCACCTCTACAAGTGGATGACGTTCGGCCTCCTG 900 GCCGACGCCGAGCATCAGCGCCTGCTCGCGTGGGAGCGCGACATGCTCGACGCGATGGGG 960 CGGCTGCGGCTCGTAGTCGCGGACGAGCGCACCCTCGCGCTGTACGAGCTGCGCTACCCC 960 CTTCCGTACCGCGTCATCGACGTCGCCGGTGGCGACCTCGGATCGTCCGCGGCCCGCAAG 1020 GAAGGCATGGCGCAGTAGCTGCAGCGGCCACCGCTGGAGCCTAGCAGGCGCCGGGCGTTC 1020 TTCGACTGCGAGGCTTGGGTTCCCACGCAGCAGGCCTACCGCGAGCTGACGTCGACGTCG 1080 AAGCTGACGCTCCGAACCCAAGGGTGCGTCGTCCGGATGGCGCTCGACTGCAGCTGCAGC 1080 AACTGCACCACCTACCAGGCGCGCCGCCTGAGCGTGCGGTACCGCGACGAGAACGGCAAG 1140 TTGACGTGGTGGATGGTCCGCGCGGCGGACTCGCACGCCATGGCGCTGCTCTTGCCGTTC 1140 CCGCAGACCGCGGCAACCCTCAACGGCACCCTCGCCACCACCCGCTGGCTCGTTGCGATC 1200 GGCGTCTGGCGCCGTTGGGAGTTGCCGTGGGAGCGGTGGTGGGCGACCGAGCAACGCTAG 1200 CTCGAAAACCACCAGCAGGCAGACGGTTCCGTGCGTGTCCCGGCTGCACTCGTGCCCTTC 1260 GAGCTTTTGGTGGTCGTCCGTCTGCCAAGGCACGCACAGGGCCGACGTGAGCACGGGAAG 1260 GTCGGGCGTGAGGTGCTGACGGCGCCGTAG 3´ 1290 CAGCCCGCACTCCA<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CGACTGCCGCGGCATC 5´ 1290 PRIMER 1: 5´ TCC CCGCGG  <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; font-family: "Courier New"; color: blue; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAG 3´ PRIMER 2: 5´ <span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; color: fuchsia; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCACGACGACCAGCCCGC <span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; color: blue; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GGCGCCGTCCTGCACG 3´ PRIMER 3: 5´ <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; color: blue; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CGTGCAGGACGGCGCC <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; color: fuchsia; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGGGCTGGTCGTCGTGC 3´ PRIMER 4: 5´ TCC CCGCGG <span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; font-size: 10pt; font-family: "Courier New"; color: fuchsia; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTACGGCGCCGTCAGC 3´ PUNTO CORTE SacII : 5´ TCC CCGCGG GGA 3´

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 * ANEXO V **

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 * MUTACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO **

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code code A R  R  N  Q  V  G  F  V  V  V  I  D  L  K  F  L  R  E  N  P  D  A  V  R  T  S  Q  R  T  R  G  E  D   F1 code

code R G  V  T  K  *  G  L  W  S  *  L  T  S  S  S  F  A  R  T  P  T  P  S  A  P  R  S  A  P  A  A  K     F2 code

code A A  *  P  S  R  V  C  G  R  D  *  P  Q  V  P  S  R  E  P  R  R  R  P  H  L  A  A  H  P  R  R  R    F3 code

code 1 <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAGG GTTTGTGGTCGTGATTGACCTCAAGTTCCTTCGCGAGAACCCCGACGCCGTCCGCACCTCGCAGCGCACCCGCGGCGAAG 100 code

code :|:|:|:|:|:|:|:|:|:| code

code 1 CGCGCCGCATTGGTTCATCCCAAACACCAGCACTAACTGGAGTTCAAGGAAGCGCTCTTGGGGCTGCGGCAGGCGTGGAGCGTCGCGTGGGCGCCGCTTC 100 code

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code P G  L  V  D  A  L  L  E  A  D  A  S  R  R  A  A  I  L  A  G  D  T  L  R  A  E  Q  K  A  F  G  K    F1 code

code T P  V  W  S  T  R  C  S  R  P  M  H  P  A  A  P  R  S  W  P  A  T  R  C  A  P  S  R  R  R  S  A  R   F2 code

code P R  S  G  R  R  A  A  R  G  R  C  I  P  P  R  R  D  P  G  R  R  H  A  A  R  R  A  E  G  V  R  Q     F3 code

code 101 ACCCCGGTCTGGTCGACGCGCTGCTCGAGGCCGATGCATCCCGCCGCGCCGCGATCCTGGCCGGCGACACGCTGCGCGCCGAGCAGAAGGCGTTCGGCAA 200 code

code :|:|:|:|:|:|:|:|:|:| code

code 101 TGGGGCCAGACCAGCTGCGCGACGAGCTCCGGCTACGTAGGGCGGCGCGGCGCTAGGACCGGCCGCTGTGCGACGCGCGGCTCGTCTTCCGCAAGCCGTT 200 code

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code K V  G  Q  A  S  P  E  E  R  P  A  L  L  A  G  S  K  E  L  A  Q  K  V  K  D  A  E  A  A  Q  H  E     F1 code

code R W  G  R  P  H  P  R  S  V  P  H  C  S  P  A  P  R  N  W  R  R  R  *  R  T  P  R  P  P  S  T  R    F2 code

code E G  G  A  G  L  T  R  G  A  S  R  T  A  R  R  L  Q  G  T  G  A  E  G  E  G  R  R  G  R  P  A  R  G   F3 code

code 201 GAAGGTGGGGCAGGCCTCACCCGAGGAGCGTCCCGCACTGCTCGCCGGCTCCAAGGAACTGGCGCAGAAGGTGAAGGACGCCGAGGCCGCCCAGCACGAG 300 code

code :|:|:|:|:|:|:|:|:|:| code

code 201 CTTCCACCCCGTCCGGAGTGGGCTCCTCGCAGGGCGTGACGAGCGGCCGAGGTTCCTTGACCGCGTCTTCCACTTCCTGCGGCTCCGGCGGGTCGTGCTC 300 code

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code A Q  A  K  L  D  E  A  H  R  A  I  S  N  I  V  Q  D  G  A  P  A  G  G  E  D  D  F  I  T  L  E  T  V   F1 code

code R R  P  S  W  T  R  R  T  A  R  S  P  T  S  C  R  T  A  P  R  P  A  A  R  T  T  S  S  P  S  R  R     F2 code

code A G  Q  A  G  R  G  A  P  R  D  L  Q  H  R  A  G  R  R  P  G  R  R  R  G  R  L  H  H  P  R  D  G    F3 code

code 301 GCGCAGGCCAAGCTGGACGAGGCGCACCGCGCGATCTCCAACATCGTGCAGGACGGCGCCCCGGCCGGCGGCGAGGACGACTTCATCACCCTCGAGACGG 400 code

code :|:|:|:|:|:|:|:|:|:| code

code 301 CGCGTCCGGTTCGACCTGCTCCGCGTGGCGCGCTAGAGGTTGTAGCACGTCCTGCCGCGGGGCCGGCCGCCGCTCCTGCTGAAGTAGTGGGAGCTCTGCC 400 code

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code code

code G E  I  P  T  F  D  F  E  P  K  D  H  L  E  L  G  E  S  L  G  L  I  D  M  E  R  G  A  K  V  S  G    F1 code

code S A  R  S  R  R  S  T  S  S  R  R  T  T  S  S  S  V  S  R  W  G  *  S  T  W  S  A  A  P  R  C  R  A   F2 code

code R R  D  P  D  V  R  L  R  A  E  G  P  P  R  A  R  *  V  A  G  A  D  R  H  G  A  R  R  Q  G  V  G     F3 code

code 401 TCGGCGAGATCCCGACGTTCGACTTCGAGCCGAAGGACCACCTCGAGCTCGGTGAGTCGCTGGGGCTGATCGACATGGAGCGCGGCGCCAAGGTGTCGGG 500 code

code :|:|:|:|:|:|:|:|:|:| code

code 401 AGCCGCTCTAGGGCTGCAAGCTGAAGCTCGGCTTCCTGGTGGAGCTCGAGCCACTCAGCGACCCCGACTAGCTGTACCTCGCGCCGCGGTTCCACAGCCC 500 code

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code S R  F  Y  F  L  T  G  F  G  A  M  L  Q  L  G  M  L  Q  L  A  A  Q  K  A  M  A  N  G  F  T  M  M     F1 code

code R G  S  T  S  S  P  A  S  A  R  C  S  S  S  A  C  C  S  W  R  R  R  R  R  W  P  T  D  S  P  *  *    F2 code

code L A  V  L  L  P  H  R  L  R  R  D  A  P  A  R  H  A  A  A  G  G  A  E  G  D  G  Q  R  I  H  H  D  D   F3 code

code 501 CTCGCGGTTCTACTTCCTCACCGGCTTCGGCGCGATGCTCCAGCTCGGCATGCTGCAGCTGGCGGCGCAGAAGGCGATGGCCAACGGATTCACCATGATG 600 code

code :|:|:|:|:|:|:|:|:|:| code

code 501 GAGCGCCAAGATGAAGGAGTGGCCGAAGCCGCGCTACGAGGTCGAGCCGTACGACGTCGACCGCCGCGTCTTCCGCTACCGGTTGCCTAAGTGGTACTAC 600 code

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code I P  P  V  L  V  R  P  E  V  M  Q  G  T  <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">G  F  L  G  Q  H  S  D  E  V  Y  H  L  A  D  D  D  L  Y  L   F1 code

code S R  R  C  W  C  A  P  R  S  C  R  A  P  A  S  S  A  S  T  R  T  R  S  T  T  W  P  T  T  T  C  T     F2 code

code P A  G  A  G  A  P  R  G  H  A  G  H  R  L  P  R  P  A  L  G  R  G  L  P  P  G  R  R  R  P  V  P    F3 code

code 601 ATCCCGCCGGTGCTGGTGCGCCCCGAGGT<span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CATGCAGGGCACC <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GGC <span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TTCCTCGGCC AGCACTCGGACGAGGTCTACCACCTGGCCGACGACGACCTGTACC 700 code

code :|:|:|:|:|:|:|:|:|:| code

code 601 TAGGGCGGCCACGACCACGCGGGGCTCCA<span style="background: blue none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GTACGTCCCGTGG <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CCG <span style="background: blue none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">AAGGAGCCGG TCGTGAGCCTGCTCCAGATGGTGGACCGGCTGCTGCTGGACATGG 700 code

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code S S  A  P  P  R  S  R  S  P  V  T  T  R  A  R  S  S  T  C  R  T  A  P  S  G  T  R  A  G  R  R  A  S   F2 code

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code 701 TCGTCGGCACCTCCGAGGTCCCGCTCGCCGGTTACCACTCGGGCGAGATCCTCGACCTGTCGAACGGCCCCAAGCGGTACGCGGGCTGGTCGTCGTGCTT 800 code

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code 701 AGCAGCCGTGGAGGCTCCAGGGCGAGCGGCCAATGGTGAGCCCGCTCTAGGAGCTGGACAGCTTGCCGGGGTTCGCCATGCGCCCGACCAGCAGCACGAA 800 code

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code A A  R  P  A  A  T  A  R  T  R  A  A  S  S  A  S  T  S  S  T  R  W  R  C  S  P  T  A  S  R  R  T    F2 code

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code 801 CCGCCGCGAGGCCGGCAGCTACGGCAAGGACACGCGCGGCATCATCCGCGTCCACCAGTTCGACAAGGTGGAGATGTTCACCTACTGCAAGCCGGAGGAC 900 code

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code 801 GGCGGCGCTCCGGCCGTCGATGCCGTTCCTGTGCGCGCCGTAGTAGGCGCAGGTGGTCAAGCTGTTCCACCTCTACAAGTGGATGACGTTCGGCCTCCTG 900 code

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code A D  A  E  H  Q  R  L  L  A  W  E  R  D  M  L  D  A  M  G  L  P  Y  R  V  I  D  V  A  G  G  D  L  G   F1 code

code P T  P  S  I  S  A  C  S  R  G  S  A  T  C  S  T  R  W  G  F  R  T  A  S  S  T  S  P  V  A  T  S     F2 code

code R R  R  A  S  A  P  A  R  V  G  A  R  H  A  R  R  D  G  A  S  V  P  R  H  R  R  R  R  W  R  P  R    F3 code

code 901 GCCGACGCCGAGCATCAGCGCCTGCTCGCGTGGGAGCGCGACATGCTCGACGCGATGGGGCTTCCGTACCGCGTCATCGACGTCGCCGGTGGCGACCTCG 1000 code

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code 901 CGGCTGCGGCTCGTAGTCGCGGACGAGCGCACCCTCGCGCTGTACGAGCTGCGCTACCCCGAAGGCATGGCGCAGTAGCTGCAGCGGCCACCGCTGGAGC 1000 code

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code S S  A  A  R  K  F  D  C  E  A  W  V  P  T  Q  Q  A  Y  R  E  L  T  S  T  S  N  C  T  T  Y  Q  A    F1 code

code D R  P  R  P  A  S  S  T  A  R  L  G  F  P  R  S  R  P  T  A  S  *  R  R  R  R  T  A  P  P  T  R  R   F2 code

code I V  R  G  P  Q  V  R  L  R  G  L  G  S  H  A  A  G  L  P  R  A  D  V  D  V  E  L  H  H  L  P  G     F3 code

code 1001 GATCGTCCGCGGCCCGCAAGTTCGACTGCGAGGCTTGGGTTCCCACGCAGCAGGCCTACCGCGAGCTGACGTCGACGTCGAACTGCACCACCTACCAGGC 1100 code

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code 1001 CTAGCAGGCGCCGGGCGTTCAAGCTGACGCTCCGAACCCAAGGGTGCGTCGTCCGGATGGCGCTCGACTGCAGCTGCAGCTTGACGTGGTGGATGGTCCG 1100 code

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code R R  L  S  V  R  Y  R  D  E  N  G  K  P  Q  T  A  A  T  L  N  G  T  L  A  T  T  R  W  L  V  A  I     F1 code

code A A  *  A  C  G  T  A  T  R  T  A  S  R  R  P  R  Q  P  S  T  A  P  S  P  P  P  A  G  S  L  R  S    F2 code

code A P  P  E  R  A  V  P  R  R  E  R  Q  A  A  D  R  G  N  P  Q  R  H  P  R  H  H  P  L  A  R  C  D  P   F3 code

code 1101 GCGCCGCCTGAGCGTGCGGTACCGCGACGAGAACGGCAAGCCGCAGACCGCGGCAACCCTCAACGGCACCCTCGCCACCACCCGCTGGCTCGTTGCGATC 1200 code

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code 1101 CGCGGCGGACTCGCACGCCATGGCGCTGCTCTTGCCGTTCGGCGTCTGGCGCCGTTGGGAGTTGCCGTGGGAGCGGTGGTGGGCGACCGAGCAACGCTAG 1200 code

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code L E  N  H  Q  Q  A  D  G  S  V  R  V  P  A  A  L  V  P  F  V  G  R  E  V  L  T  A  P  *               F1 code

code S K  T  T  S  R  Q  T  V  P  C  V  S  R  L  H  S  C  P  S  S  G  V  R  C  *  R  R  R  X              F2 code

code R K  P  P  A  G  R  R  F  R  A  C  P  G  C  T  R  A  L  R  R  A  *  G  A  D  G  A  V  X             F3 code

code 1201 CTCGAAAACCACCAGCAGGCAGACGGTTCCGTGCGTGTCCCGGCTGCACTCGTGCCCTTCGTCGGGCGTGAGGTGCTGACGGCGCCGTAG 1290 code

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code 1201 GAGCTTTTGGTGGTCGTCCGTCTGCCAAGGCACGCACAGGGCCGACGTGAGCACGGGAAGCAGCCCGCACT<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CCACGACTGCCGCGGCATC 1300 code

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code PRIMER 1: 5´ CGC GGATCC <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; font-family: Courier; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAGG 3´

PRIMER 2: 5´ <span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; font-family: Courier; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CATGCAGGGCACC <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; font-family: Courier; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GTC <span style="background: fuchsia none repeat scroll 0% 0%; font-family: Courier; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TTCCTCGGCC 3´ PRIMER 3: 5´<span style="background: blue none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GGCCGAGGAA <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GAC <span style="background: blue none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GGTGCCCTGCATG 3´

PRIMER 4: 5´ CGC GGATCC <span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; font-family: Courier; text-transform: uppercase; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTACGGCGCCGTCAGCACC 3´ code code code

code SITIO DE CORTE BamHI : 5´ CGC GGATCC GCG 3´ CAMBIAMOS EL CODÓN GGC (GLICINA) POR GTC (VALINA) code

code ** ANEXO VI ** ** FUSIÓN CON PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE ** gcgcggcgtaaccaagtagggtttgtggtcgtgattgacctcaagttccttcgcgagaaccccgacgccgtccgcacctcgcagcgcacccgcggcgaagaccccggtctggtcgacgcgctgctcgaggccgatgcatcccgccgcgccgcgatcctggccggcgacacgctgcgcgccgagcagaaggcgttcggcaagaaggtggggcaggcctcacccgaggagcgtcccgcactgctcgccggctccaaggaactggcgcagaaggtgaaggacgccgaggccgcccagcacgaggcgcaggccaagctggacgaggcgcaccgcgcgatctccaacatcgtgcaggacggcgccccggccggcggcgaggacgacttcatcaccctcgagacggtcggcgagatcccgacgttcgacttcgagccgaaggaccacctcgagctcggtgagtcgctggggctgatcgacatggagcgcggcgccaaggtgtcgggctcgcggttctacttcctcaccggcttcggcgcgatgctccagctcggcatgctgcagctggcggcgcagaaggcgatggccaacggattcaccatgatgatcccgccggtgctggtgcgccccgaggtcatgcagggcaccggcttcctcggccagcactcggacgaggtctaccacctggccgacgacgacctgtacctcgtcggcacctccgaggtcccgctcgccggttaccactcgggcgagatcctcgacctgtcgaacggccccaagcggtacgcgggctggtcgtcgtgcttccgccgcgaggccggcagctacggcaaggacacgcgcggcatcatccgcgtccaccagttcgacaaggtggagatgttcacctactgcaagccggaggacgccgacgccgagcatcagcgcctgctcgcgtgggagcgcgacatgctcgacgcgatggggcttccgtaccgcgtcatcgacgtcgccggtggcgacctcggatcgtccgcggcccgcaagttcgactgcgaggcttgggttcccacgcagcaggcctaccgcgagctgacgtcgacgtcgaactgcaccacctaccaggcgcgccgcctgagcgtgcggtaccgcgacgagaacggcaagccgcagaccgcggcaaccctcaacggcaccctcgccaccacccgctggctcgttgcgatcctcgaaaaccaccagcaggcagacggttccgtgcgtgtcccggctgcactcgtgcccttcgtcgggcgtgaggtgctgacggcgccgtag ** DOBLE CADENA ** PROTEINA SERYL 5´ <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GCGCGGCGTAACCAAGTAG GGTTTGTGGTCGTGATTGACCTCAAGTTCCTTCGCGAGAAC 60 3´ CGCGCCGCATTGGTTCATCCCAAACACCAGCACTAACTGGAGTTCAAGGAAGCGCTCTTG 60 CCCGACGCCGTCCGCACCTCGCAGCGCACCCGCGGCGAAGACCCCGGTCTGGTCGACGCG 120 GGGCTGCGGCAGGCGTGGAGCGTCGCGTGGGCGCCGCTTCTGGGGCCAGACCAGCTGCGC 120 CTGCTCGAGGCCGATGCATCCCGCCGCGCCGCGATCCTGGCCGGCGACACGCTGCGCGCC 180 GACGAGCTCCGGCTACGTAGGGCGGCGCGGCGCTAGGACCGGCCGCTGTGCGACGCGCGG 180 GAGCAGAAGGCGTTCGGCAAGAAGGTGGGGCAGGCCTCACCCGAGGAGCGTCCCGCACTG 240 CTCGTCTTCCGCAAGCCGTTCTTCCACCCCGTCCGGAGTGGGCTCCTCGCAGGGCGTGAC 240 CTCGCCGGCTCCAAGGAACTGGCGCAGAAGGTGAAGGACGCCGAGGCCGCCCAGCACGAG 300 GAGCGGCCGAGGTTCCTTGACCGCGTCTTCCACTTCCTGCGGCTCCGGCGGGTCGTGCTC 300 GCGCAGGCCAAGCTGGACGAGGCGCACCGCGCGATCTCCAACATCGTGCAGGACGGCGCC 360 CGCGTCCGGTTCGACCTGCTCCGCGTGGCGCGCTAGAGGTTGTAGCACGTCCTGCCGCGG 360 CCGGCCGGCGGCGAGGACGACTTCATCACCCTCGAGACGGTCGGCGAGATCCCGACGTTC 420 GGCCGGCCGCCGCTCCTGCTGAAGTAGTGGGAGCTCTGCCAGCCGCTCTAGGGCTGCAAG 420 GACTTCGAGCCGAAGGACCACCTCGAGCTCGGTGAGTCGCTGGGGCTGATCGACATGGAG 480 CTGAAGCTCGGCTTCCTGGTGGAGCTCGAGCCACTCAGCGACCCCGACTAGCTGTACCTC 480 CGCGGCGCCAAGGTGTCGGGCTCGCGGTTCTACTTCCTCACCGGCTTCGGCGCGATGCTC 540 GCGCCGCGGTTCCACAGCCCGAGCGCCAAGATGAAGGAGTGGCCGAAGCCGCGCTACGAG 540 CAGCTCGGCATGCTGCAGCTGGCGGCGCAGAAGGCGATGGCCAACGGATTCACCATGATG 600 GTCGAGCCGTACGACGTCGACCGCCGCGTCTTCCGCTACCGGTTGCCTAAGTGGTACTAC 600 ATCCCGCCGGTGCTGGTGCGCCCCGAGGTCATGCAGGGCACCGGCTTCCTCGGCCAGCAC 660 TAGGGCGGCCACGACCACGCGGGGCTCCAGTACGTCCCGTGGCCGAAGGAGCCGGTCGTG 660 TCGGACGAGGTCTACCACCTGGCCGACGACGACCTGTACCTCGTCGGCACCTCCGAGGTC 720 AGCCTGCTCCAGATGGTGGACCGGCTGCTGCTGGACATGGAGCAGCCGTGGAGGCTCCAG 720 CCGCTCGCCGGTTACCACTCGGGCGAGATCCTCGACCTGTCGAACGGCCCCAAGCGGTAC 780 GGCGAGCGGCCAATGGTGAGCCCGCTCTAGGAGCTGGACAGCTTGCCGGGGTTCGCCATG 780 GCGGGCTGGTCGTCGTGCTTCCGCCGCGAGGCCGGCAGCTACGGCAAGGACACGCGCGGC 840 CGCCCGACCAGCAGCACGAAGGCGGCGCTCCGGCCGTCGATGCCGTTCCTGTGCGCGCCG 840 ATCATCCGCGTCCACCAGTTCGACAAGGTGGAGATGTTCACCTACTGCAAGCCGGAGGAC 900 TAGTAGGCGCAGGTGGTCAAGCTGTTCCACCTCTACAAGTGGATGACGTTCGGCCTCCTG 900 GCCGACGCCGAGCATCAGCGCCTGCTCGCGTGGGAGCGCGACATGCTCGACGCGATGGGG 960 CGGCTGCGGCTCGTAGTCGCGGACGAGCGCACCCTCGCGCTGTACGAGCTGCGCTACCCC 960 CTTCCGTACCGCGTCATCGACGTCGCCGGTGGCGACCTCGGATCGTCCGCGGCCCGCAAG 1020 GAAGGCATGGCGCAGTAGCTGCAGCGGCCACCGCTGGAGCCTAGCAGGCGCCGGGCGTTC 1020 TTCGACTGCGAGGCTTGGGTTCCCACGCAGCAGGCCTACCGCGAGCTGACGTCGACGTCG 1080 AAGCTGACGCTCCGAACCCAAGGGTGCGTCGTCCGGATGGCGCTCGACTGCAGCTGCAGC 1080 AACTGCACCACCTACCAGGCGCGCCGCCTGAGCGTGCGGTACCGCGACGAGAACGGCAAG 1140 TTGACGTGGTGGATGGTCCGCGCGGCGGACTCGCACGCCATGGCGCTGCTCTTGCCGTTC 1140 CCGCAGACCGCGGCAACCCTCAACGGCACCCTCGCCACCACCCGCTGGCTCGTTGCGATC 1200 GGCGTCTGGCGCCGTTGGGAGTTGCCGTGGGAGCGGTGGTGGGCGACCGAGCAACGCTAG 1200 CTCGAAAACCACCAGCAGGCAGACGGTTCCGTGCGTGTCCCGGCTGCACTCGTGCCCTTC 1260 GAGCTTTTGGTGGTCGTCCGTCTGCCAAGGCACGCACAGGGCCGACGTGAGCACGGGAAG 1260 GTCGGGCGTGA<span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GGTGCTGACGGCGCCG TAG 3´ 1290 CAGCCCGCACT<span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CCACGACTGCCGCGGC ATC 5´ 1290 PROTEINA GFP code >gfp code code ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATG code

code GGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTAT code

code TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGGTTATGGTGTTCAATGC code

code TTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCTGAAGGTTATGTAC code

code AGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGA code

code TACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAA code

code TTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTA code

code ACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCC code

code AATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGAT code

code CCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGG code

code ATGAACTATACAAATAA code

5´ <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">ATGAGTAAAGGAGAAG AACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGT 60 3´ <span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TACTCATTTCCTCTTC TTGAAAAGTGACCTCAACAGGGTTAAGAACAACTTAATCTACCA 60

GATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGA 120 CTACAATTACCCGTGTTTAAAAGACAGTCACCTCTCCCACTTCCACTACGTTGTATGCCT 120

AAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTT 180 TTTGAATGGGAATTTAAATAAACGTGATGACCTTTTGATGGACAAGGTACCGGTTGTGAA 180

GTCACTACTTTCGGTTATGGTGTTCAATGCTTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAG 240 CAGTGATGAAAGCCAATACCACAAGTTACGAAACGCTCTATGGGTCTAGTATACTTTGTC 240

CATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCTGAAGGTTATGTACAGGAAAGAACTATATTTTTC 300 GTACTGAAAAAGTTCTCACGGTACGGACTTCCAATACATGTCCTTTCTTGATATAAAAAG 300

AAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTT 360 TTTCTACTGCCCTTGATGTTCTGTGCACGACTTCAGTTCAAACTTCCACTATGGGAACAA 360

AATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAA 420 TTATCTTAGCTCAATTTTCCATAACTAAAATTTCTTCTACCTTTGTAAGAACCTGTGTTT 420

TTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGA 480 AACCTTATGTTGATATTGAGTGTGTTACATATGTAGTACCGTCTGTTTGTTTTCTTACCT 480

ATCAAAGTTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGAC 540 TAGTTTCAATTGAAGTTTTAATCTGTGTTGTAACTTCTACCTTCGCAAGTTGATCGTCTG 540

CATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTAC 600 GTAATAGTTGTTTTATGAGGTTAACCGCTACCGGGACAGGAAAATGGTCTGTTGGTAATG 600

CTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTT 660 GACAGGTGTGTTAGACGGGAAAGCTTTCTAGGGTTGCTTTTCTCTCTGGTGTACCAGGAA 660

CTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAATAA 3´ 717 GAACTCAAACATTGTCGACGACCCTAATGTGTACCGTA<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CCTACTTGATATGTTTATT 5´ 717

PRIMER 1: 5´ CCG GAATTC <span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; font-size: 10pt;">GCGCGGCGTAACCAAGTAG 3´

PRIMER 2: 5´<span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; color: green; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTTCTCCTTTACTCAT <span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; color: navy; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CGGCGCCGTCAGCACC 3´

PRIMER 3: 5´<span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; color: navy; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">GGTGCTGACGGCGCCG <span style="background: aqua none repeat scroll 0% 0%; color: green; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">ATGAGTAAAGGAGAAG 3´

PRIMER 4: 5´ CCG GAATTC <span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; font-size: 10pt;">TTATTTGTATAGTTCATCC 3´

SITIO CORTE EcoRI : 5´ CCG GAATTC CGG 3´


 * BIBLIOGRAFIA **
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