Cristina+Carrera

Trabajo de Ingeniería genética de microorganismos

Esto no era lo que se pedía. Habia que presentar el trabajo en la Wiki, no como documento doc. Se lo he pasado a wiki. No ha escrito el trabajo, no ha metido bibliografía.......JAG



**__TRABAJO DE INGENIERÍA GENÉTICA__**

**RESUMEN:**

En este trabajo se nos ha encargado el análisis de una secuencia de 17000pb de un microorganismo desconocido. Mediante el Programa informático Artemis se obtuvieron los ORFs que codificaban paras las distintas proteínas y de esta manera se eligió una de ellas para realizar un estudio más concreto de su función, estructura, etc. mediante diversos programas informáticos

El género //Rhodococcus// pertenece a un grupo de microorganismos aerobios de alto contenido en G+C. Son bacterias Gram posisitivas, no esporuladas que se han encontrado ampliamente distribuidos en el medio ambiente y sobre todo en suelos, reservorios de aguas, ríos, lagos y otros ambientes acuáticos. Se ha encontrado que este grupo de bacterias está relacionado con //Mycobacterium, Corynebacterium,Nocardia y Gordonia.//
 * INTRODUCCIÓN**

En cuanto a su clasificación taxonómica: -Clase Actinobacteria -Subclase //Actinobacteridae// -Orden //Actinomycetales// -Suborden //Corynebarterineae,// -Familia //Nocardiaceae// //-////G//énero //Rhodococcus//.


 * ANÁLISIS DE INFORMÁTICOS DE** **LA SECUENCIA** **MEDIANTE** **EL PROGRAMA ARTEMIS**

Analizando la secuencia de 17000 pb mediante el programa informático Artemis se obtuvieron los distintos ORFs que codificaban para las distintas proteínas de la bacteria. Fig.1.Obtención de los ORFs de la secuencia mediante el programa Artemio.

De esta manera elegimos la proteína Lysyl-tRNA synthetase. La secuencia de esta proteína es la siguiente: atgcctccatcttcctccttggccccaaacgggccatcgacgcctcacactggactcggagagacgacagtcactggaaggacctcgatggccacgagtaccggtagccctgtggacaccacggacaggcgggaccaccaccagacccgggtgacgccgaaacgcgggcggctgtcggaggttccgcacatcgcgggcctcgtcctcggcgtcttctcggtgctggtgttcctgtggagcctgtcgcccgcgctgcgctacctggtgcacacgccgcgcctgtacatcgacgactactacttcgacgcccccgacacgagcctgtcgtgggccgtcgtggtcggtctggtggcggccgcactcgcgagccgcaaacggatcgcgtggtggttgctgacgatctacctgaccctcttcgcagttctcaacgcggtcaccgcggtggcggacgagaacgtcaacgccgccgtcgcgtgcgtcgtgcagctcgcggtcgtcgggatcctgatcgcggcccgcaaggagttctacacgcgggtccgccgcggcgccgcgtggaaggcattgggcgtcctcgtgtccggcctggcggtgggcaccctgctgggctgggggctggtggagctgttcccgggcacgctgccgtcgggtcagcggttcctgtgggccctcaaccgcgtcaccgccctcgtcgtggtcgagaacgaacagttcgacggccacccccacgtcttcgtcaacaccctgctgggactgttcggggcgctcgccctgctcgcggcggtgatcacgctgttccgctcgcagcgggcgtcgaacgcgctgaccggcgacgacgaatcggcgttgcgcggcctgctcgacagcttcggtgccgacgactccctgggctacttcgcgacccgccgcgacaaggccgtcgtcttcgctccgagcggcaaggccgccgtcacctaccgcgtggagatcggcgtgtgcctggccagcggcgacccgatcggcaacccggaggcgtggccgcacgcgatcgacgcgtggctcgccctgtgctccaagtacggctgggcgcccgccgtgatgggagcgagcgaggccggcgccaccgcgtacaagcgggccggtctgtcggtgctccagctcggcgacgaggcgatcctcgaaacccgggagttcaatctgaacggccgcgagatgcggcaggtccgccaggccgtgcaccgggtccggaagcagggcgtcaccgtccgcatccgacgccaccgcgacatcccgcccgccgagatggccgacgtcgtcgcgcgtgcagatgcgtggcgcgacaccgagaccgagcgcggcttctcgatggccctgggccggctcggcgatcccctcgacggcgactgcctcctggtcgaggcgctcggcgaggacggcacggtgctgggcatgctgtcgctggtgccgtggggtccgaacggcgcatcgctcgacctgatgcgccggaacccggacgcccccaacggtgtagtcgaactgatggtcaccgaactcgcgacccgttccgacgagttcggcgtcgtgcgggtgtcgctcaacttcgcggtgttccgctccacgttcgaggagggcgcgcgcatcggcgccggtccgatcctgcgggtctggcggtcgatgctgctgttcttctcccggtggtggcagctcgaggctctgtaccgctcgaacgtcaagtaccagcccgaatgggcgccgcggtacctgtgcttcgacgacaaccggcagctgccgcgcgtcggaatcgcgtcggcgatcgccgagggtttcctgacgttgcccacgttcgggcaccgggcgaaggcgcccacgcacaccgggacccgcgccgcggtgccggcggcgctcgccgtctccggtgtcctgcacgcggacggcagtgcgcccgacgccgccgctccggcggccgacgcgcccacgggcaggacggacgggacggccccggaatcggtgggaccgcgccggcccgaacaggttcgcgtgcgcatggacaaactcgcccgcctggccgacgagggcatcgatccgtaccccgtcgcctacccgcccacccacaccgtcgccgccgcgacgtcgtccccggagggcacccgcgtgcgaatcgcggggcgcctgttgcggatccgcacgtacggcggcgtcgcgttcgcggtgctgcgggactggtccggcgacatccaggtgctcatcgaacgcaccacggtcggcgaccggctcgacgagttctccaccgacttcgacctcggcgacctcatggaggtgagcggcaccatcggccgcagccgcaagggtgaactgtcgctgctggcgacggagtggcgcatgaacggcaaatgcctgcaccccctgcccgacaagtggaagggcttgacggacgcggaaactcgcgtgcggcagcgttacgtcgacctcgcgatcaaccccgagtcgcggcggctgctggcggcgcgtaccgcgatcgtgaagtcgctgcgcgacaccctcgccggccgcgactacctcgaggtggagacgccgatcctgcagcgtatccacggcggcgccaacgcggcccccttcgtcacccatatcaatgcgtacgacctggacctgtacctgcggatcgcaccggagttgttcctcaaacgtctgtgtgtggccggtatggagaaggtgttcgagatcgggcgggtgttccgcaacgagggcgtcgacttcaagcacaacccggagttcacgatcctcgaggcgtacgaggcccacagcgactacgaacgcatgatggtgctgtgccgcgagctgatccaggccgcggccgtcgccgcacacggcagccagacgatcatgcgtcccggcccggacggcgaactcgtcgccgtcgacatctccggcgaatggcccgtgaagacgatgcacggcgcggtcgccgagaaactgggcgtggacgtcagcccggagacacccctcgaggtgctgcagaagttgtgcgacgagaacgacatcgagtaccagaagagctgggacgcaggcgcggtcgcgcaggagatgtacgagcatctggtggagggtcagaccgagttccccaccttctacaccaacttcccgacgtcgatgtcgccgctgacccgcccccaccccaccatccccggtgtggccgcgaagtgggatctggtggcgtggggcgtcgaactcggcaccgcgtacagcgaactcaccgatcccatcgaccagcgacgacggctcaccgagcagtcgctgctcgcggccggcggcgacgcggaggcgatggaactcgacgaggacttcctgcaggcgctcgagcacgcgatgccgcccaccggcgggctcggtatgggcgtcgaccggatcgtcatgctcatcaccggcggcagcatccgcgaatcgctggcgttcccgttcgccaagccgcgcaactga La lisil-tRNA sintetasa es una proteína específica que cataliza la primera reacción que sufren los aminoácidos para intervenir en la biosíntesis de proteínas que es la unión al tRNA, en este caso, a la lisina. Por tanto se trata de una proteína importante para la síntesis de proteínas en //Rhodococcus////.//
 * ESTUDIO DE** **LA PROTEÍNA**

Mediante diversos programas informáticos se analizaron distintos aspectos de la proteína. El inicio de la proteína es VTPKRGRL [|__M__] P P S S S L A P N G P S T P H T G L G E T T V T G R T S [|__M__] A T S T G S P V D T T D R R D H H Q T R V T P K R G R L S E V P H I A G L V L G V F S V L V F L W S L S P A L R Y L V H T P R L Y I D D Y Y F D A P D T S L S W A V V V G L V A A A L A S R K R I A W W L L T I Y L T L F A V L N A V T A V A D E N V N A A V A C V V Q L A V V G I L I A A R K E F Y T R V R R G A A W K A L G V L V S G L A V G T L L G W G L V E L F P G T L P S G Q R F L W A L N R V T A L V V V E N E Q F D G H P H V F V N T L L G L F G A L A L L A A V I T L F R S Q R A S N A L T G D D E S A L R G L L D S F G A D D S L G Y F A T R R D K A V V F A P S G K A A V T Y R V E I G V C L A S G D P I G N P E A W P H A I D A W L A L C S K Y G W A P A V [|__M__] G A S E A G A T A Y K R A G L S V L Q L G D E A I L E T R E F N L N G R E [|__M__] R Q V R Q A V H R V R K Q G V T V R I R R H R D I P P A E [|__M__] A D V V A R A D A W R D T E T E R G F S [|__M__] A L G R L G D P L D G D C L L V E A L G E D G T V L G [|__M__] L S L V P W G P N G A S L D L [|__M__] R R N P D A P N G V V E L [|__M__] V T E L A T R S D E F G V V R V S L N F A V F R S T F E E G A R I G A G P I L R V W R S [|__M__] L L F F S R W W Q L E A L Y R S N V K Y Q P E W A P R Y L C F D D N R Q L P R V G I A S A I A E G F L T L P T F G H R A K A P T H T G T R A A V P A A L A V S G V L H A D G S A P D A A A P A A D A P T G R T D G T A P E S V G P R R P E Q V R V R [|__M__] D K L A R L A D E G I D P Y P V A Y P P T H T V A A A T S S P E G T R V R I A G R L L R I R T Y G G V A F A V L R D W S G D I Q V L I E R T T V G D R L D E F S T D F D L G D L [|__M__] E V S G T I G R S R K G E L S L L A T E W R [|__M__] N G K C L H P L P D K W K G L T D A E T R V R Q R Y V D L A I N P E S R R L L A A R T A I V K S L R D T L A G R D Y L E V E T P I L Q R I H G G A N A A P F V T H I N A Y D L D L Y L R I A P E L F L K R L C V A G [|__M__] E K V F E I G R V F R N E G V D F K H N P E F T I L E A Y E A H S D Y E R [|__M__] [|__M__] V L C R E L I Q A A A V A A H G S Q T I [|__M__] R P G P D G E L V A V D I S G E W P V K T [|__M__] H G A V A E K L G V D V S P E T P L E V L Q K L C D E N D I E Y Q K S W D A G A V A Q E [|__M__] Y E H L V E G Q T E F P T F Y T N F P T S [|__M__] S P L T R P H P T I P G V A A K W D L V A W G V E L G T A Y S E L T D P I D Q R R R L T E Q S L L A A G G D A E A [|__M__] E L D E D F L Q A L E H A [|__M__] P P T G G L G [|__M__] G V D R I V [|__M__] L I T G G S I R E S L A F P F A K P R N Stop
 * 1) SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE EL PROGRAMA EXPASY

Temperatura = 93ºC  (Una proteína no tiene temperatura de anill amiento) El contenido en G+C de la proteína es de 70% (Una proteína no tiene G+C) El peso molecular de la proteína es de 1065,126kD Using the scale [|**__Hphob. / Kyte & Doolittle__**], the individual values for the 20 amino acids are: Ala: 1.800 Arg: -4.500 Asn: -3.500 Asp: -3.500 Cys: 2.500 Gln: -3.500 Glu: -3.500 Gly: -0.400 His: -3.200 Ile: 4.500 Leu: 3.800 Lys: -3.900 Met: 1.900 Phe: 2.800 Pro: -1.600 Ser: -0.800 Thr: -0.700 Trp: -0.900 Tyr: -1.300 Val: 4.200 : -3.500 : -3.500 : -0.490
 * 1) TEMPERATURA DE ANILLAMIENTO
 * 1) CONTENIDO EN G+C
 * 1) PESO MOLECULAR
 * 1) HIDROFOBICIDAD

Weights for window positions 1,..,9, using **linear weight variation model**: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 edge center edge

MIN: -3.456 MAX: 3.133 Fig. 2. Gráfica que representa la hidrofobicidad


 * 1) DOMINIOS TRANSMEMBRANA

Sequence TMHMM2.0 inside 1 62 Sequence TMHMM2.0 TMhelix 63 85 Sequence TMHMM2.0 outside 86 99 Sequence TMHMM2.0 TMhelix 100 122 Sequence TMHMM2.0 inside 123 126 Sequence TMHMM2.0 TMhelix 127 149 Sequence TMHMM2.0 outside 150 152 Sequence TMHMM2.0 TMhelix 153 172 Sequence TMHMM2.0 inside 173 184 Sequence TMHMM2.0 TMhelix 185 207 Sequence TMHMM2.0 outside 208 1150 Fig. 3. Dominios transmembrana de la proteína lisil-tRNA sintetasa.
 * 1) Sequence Length: 1150
 * 1) Sequence Number of predicted TMHs: 5
 * 2) Sequence Exp number of AAs in TMHs: 139.22254
 * 3) Sequence Exp number, first 60 AAs: 0.46269
 * 4) Sequence Total prob of N-in: 0.74927

Según esto podemos decir que la proteína tiene varios dominios transmembrana pero que la mayor parte de ella es extracelular. (cree Ud. que una proteína de sintesis de proteínas puede estar fuera de la célula????)


 * 1) FILOGENIA DE LA PROTEÍNA
 * 1) ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA (referencia de esta estructura, de qué microorganismo procede???)

__PRIMER 1:__ __GAATTC__ atgcctccatcttcctccttg Tm=60ºC
 * DISEÑO DE PRIMERS** **PARA** **LA AMPLIFICACIÓN** **DEL** **GEN POR PCR**

PRIMER 2: __GAATTCtca__ gttgcgcggcttggcg Tm63ºC El sitio de corte usado para amplificar fue EcoRI (porqué no añade nt upstream de las secuencias de corte???


 * DISEÑO DE PRIMERS PARA AMPLIFICAR FRAGMENTOS INTERNOS DEL GEN Y COMPROBAR SI DICHO GEN ES ESENCIAL O NO PARA EL ORGANISMO**

Mediante el programa informático ClustalW2 se realizó el alineamiento de la proteína junto con la de otros cuatro microorganismos. Lo que se obtuvo haciendo esto fue lo siguiente:  Cual es la diferencia entre Rhodococcus de la primera linea y de la tercera. No le parece extraño que la proteína de la primera línea sea mucho mas larga que el resto? Que le puede indicar esto?

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] MPPSSSLAPNGPSTPHTGLGETTVTGRTSMATSTGSPVDTTDRRDHHQTRVTPKRGRLSE 60 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] VPHIAGLVLGVFSVLVFLWSLSPALRYLVHTPRLYIDDYYFDAPDTSLSWAVVVGLVAAA 120 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] LASRKRIAWWLLTIYLTLFAVLNAVTAVADENVNAAVACVVQLAVVGILIAARKEFYTRV 180 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] RRGAAWKALGVLVSGLAVGTLLGWGLVELFPGTLPSGQRFLWALNRVTALVVVENEQFDG 240 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] HPHVFVNTLLGLFGALALLAAVITLFRSQRASNALTGDDESALRGLLDSFGADDSLGYFA 300 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] TRRDKAVVFAPSGKAAVTYRVEIGVCLASGDPIGNPEAWPHAIDAWLALCSKYGWAPAVM 360 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] GASEAGATAYKRAGLSVLQLGDEAILETREFNLNGREMRQVRQAVHRVRKQGVTVRIRRH 420 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] RDIPPAEMADVVARADAWRDTETERGFSMALGRLGDPLDGDCLLVEALGEDGTVLGMLSL 480 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] VPWGPNGASLDLMRRNPDAPNGVVELMVTELATRSDEFGVVRVSLNFAVFRSTFEEGARI 540 [Frankia [Streptomyces

[Rhodococcus [Corynebacterium [Rhodococcus] GAGPILRVWRSMLLFFSRWWQLEALYRSNVKYQPEWAPRYLCFDDNRQLPRVGIASAIAE 600 [Frankia -MVDRRDWMTRAADEAIERAQQR-PGGAKVVC 30 [Streptomyces ---MPIVAQSTETTDWVSRFADEVIAESERRAPGKPGVVV 37

[Rhodococcus --MSEVAAQPVDDTP- 13 [Corynebacterium ---MTNSNPTSKNNSADLP- 16 [Rhodococcus] GFLTLPTFGHRAKAPTHTGTRAAVPAALAVSGVLHADGSAPDAAAPAADAPTGRTDGTAP 660 [Frankia ASGISPSGPIHLGNLREILVPHLVAEEIRSRGVPCEHILSWDDYDRLRKVP- 81 [Streptomyces ASGLSPSGPIHLGNLREVMTPHLVADEVRRRGHEVRHLISWDDYDRYRKVP- 88 . *

[Rhodococcus EQLRIRQEKRERILAEGREAYPVSVARTHSLAEIRAKYPELEPDT--- 58 [Corynebacterium EQLRIRREKRERILDSGLDAYPVEVDRTISISDLRSQFVVITEDLQEREEGV 68 [Rhodococcus] ESVGPRRPEQVRVRMDKLARLADEGIDPYPVAYPPTHTVAAATSS--- 705 [Frankia AGVP---ADFAEHVGRPLTAVPDPWG-EFPSWAERFKAPFRDALR--- 122 [Streptomyces AGVPGVDESWAEHIGKPLTSVPAPKGSPHPNWAEHFKAAMVDSLA--- 133

[Rhodococcus ---ATGDQVGVVGRVIFVRNTGKLCFATLQEGDGTQLQAMISLAAVGEDALALWKA 111 [Corynebacterium TYLEVGEETDVEVAIAGRVMFVRNTGKLCFASIQEGNGTTVQAMLSLAAVGEESLKAWKA 128 [Rhodococcus] ---PEGTRVRIAGRLLRIRTYGGVAFAVLRDWSG-DIQVLIERTTVG-DRLDEFST 756 [Frankia ---RLGIEVREISQTEMYRSGAYADGIARAIAAAPTIDGILGRYRTLQPSPTAAPA 175 [Streptomyces ---EMGVEFDGISQTAQYTSGVYREQILHAMKHRRDIDAILDQYRTKKAP--AKKS 184 . .. .: . :: :: . :

[Rhodococcus DVDLGDFVFVHGEVISSRRGELS-VMAD 138 [Corynebacterium DVDMGDIVSVRGKVISSKRGELS-VMAD 155 [Rhodococcus] DFDLGDLMEVSGTIGRSRKGELS-LLAT 783 [Frankia GSGPDGSGLDGSGPRASGAGGSGPGGRAGRGGRRAGAAPGGADDVPPADVDVAADEGAAD 235 [Streptomyces QKPLDEAELEAAE---GSG-AAAE 204 . . . *

[Rhodococcus SWQIASKSLRPLPVAHKEMNE-ESRVRQRYADLIVRSEARENARKRVAVVRELRNALELR 197 [Corynebacterium SWHMASKSLRPLPVAFADLSE-DTRVRHRYTDLIMREQARTNALTRIKVMRALRHYLEDQ 214 [Rhodococcus] EWRMNGKCLHPLPDKWKGLTDAETRVRQRYVDLAINPESRRLLAARTAIVKSLRDTLAGR 843 [Frankia DEGSASASAYFPFRPYCEVCGRDTTVVASFDPAAGQGDYSCSACG-NHGRFDVRGPANGK 294 [Streptomyces DDGSSGSAGYFPYKPYCGNCEKDLTTVTAYDDDSTELTYACTACG-FSETVRLSEFNRGK 263 . . . : . : . : :

[Rhodococcus GFLEVETPMLQTVAGGAAARPFITHSN-ALDIDLYLRIAPELFLKRCVVGGIEKVFEIN- 255 [Corynebacterium DFLEVETPMLQTLHGGAAARPFETHSN-ALDIDLYLRIAPELYLKRCVVGGIERVFEVN- 272 [Rhodococcus] DYLEVETPILQRIHGGANAAPFVTHIN-AYDLDLYLRIAPELFLKRLCVAGMEKVFEIG- 901 [Frankia LVWKVDWPMRWAFENVAFEAGGVDHSSPGSSFTVGGSIVREVFGGEPPVYLPYSFVGVRG 354 [Streptomyces LVWKVDWPMRWAYEGVVFEPSGVDHSSPGSSFQVGGQIVG-IFGGEQPIGPMYAFVGISG 322

[Rhodococcus --RNFRNEGVDSTHSPEFAMLETYEAYGTYDD---SAVMIRELVQEVAQAAFGSQVVT-- 308 [Corynebacterium --RNFRNEGVDSSHSPEFAMLETYEAWGTYET---GAKLIKGLVQSVAQEVFGTTLVT-- 325 [Rhodococcus] --RVFRNEGVDFKHNPEFTILEAYEAHSDYER---MMVLCRELIQAAAVAAHGSQTIMRP 956 [Frankia RAKLSGSAGGAPTPADALHILEPAIVRWIYARRRPNQAITVDFGAEVLRVYDEWDALNRR 414 [Streptomyces MAKMSSSKGGVPTPADALKIMEPQLLRWLYARRRPNQSFKIAFDQEIQRLYDEWDRLDAK 382

[Rhodococcus LADG--TEYDLSGEWKTLEMYPSLSQAIGVEVTPDTTVEE L LALAEKV 354 [Corynebacterium LADG--TEYDLGGEWKVIEMYPSLNEALAR--KFPGQPEVTIDSTVEE <span style="background-color: rgb(0, 255, 0); font-family: 'Courier New';">L REIAKVI 377 [Rhodococcus] GPDGELVAVDISGEWPVKTMHGAVAEKLGVDVSPETPLEV <span style="background-color: rgb(0, 255, 0); font-family: 'Courier New';">L QKLCDEN 1004 [Frankia VGDGAAEPAENTVVARSRGTVEGGPVDAPRTVFPFRLLSSICDITADDPTQI <span style="background-color: rgb(0, 255, 0); font-family: 'Courier New';">L RILRQAR 474 [Streptomyces VADGSALPADAAAHARAVGTAAGELPRTPR-PLPYRTLASVADITAGHEDQA <span style="background-color: rgb(0, 255, 0); font-family: 'Courier New';">L RILGELD 441 [Rhodococcus GLEVPKDKGYGHGKLVEELWEHQCGDQLFEPTFVRDFPVETSPLTRDHRSKA 406 [Corynebacterium GLSVPENGGWGHGKLVEEIWELLCEDQLYGPIFVKDFPVETSPLTRQHRTKP 429 [Rhodococcus] DIEYQKS--WDAGAVAQEMYEHLVEGQTEFPTFYTNFPTSMSPLTRPHPTIP 1054 [Frankia GSDAAGGSGADAAGQAPFSLDDLQPRLDAARAWTREHVPAEQRTIVRTEPDRAALAGLSA 534 [Streptomyces PANPIASLDEARPRYDKAEAWINTHVPADQRTIVRQEPDAELLKSLDE 489 . . . . . * :.

[Rhodococcus GVTEKWDLYIRGFELATGYSELVDPVIQRERFVDQARLASA--GDDEAMALDEEFLAAME 464 [Corynebacterium GVTEKWDLYVRGFELATGYSELIDPVIQRERFEDQARLAAD--GDDEAMVLDEDFLTAME 487 [Rhodococcus] GVAAKWDLVAWGVELGTAYSELTDPIDQRRRLTEQSLLAAG--GDAEAMELDEDFLQALE 1112 [Frankia DETKALAILVDGLEEDWSLDGLTTLTYAVPKLLRGLPADAP---ATTELKQAQRAFFVLI 591 [Streptomyces PSRQSLRLLLDGLADHWSLDGLTHHVYGVPKVQAGFPADATPKELPPEIKTAQRTFFALL 549

[Rhodococcus QGMPPTTGTGMGIDRLLMALTGLGIRETILFPIVRPSSR 503 [Corynebacterium QGMPPTSGNGMGIDRLLMALTGLGIRETVLFPMVKPEQK 526 [Rhodococcus] HAMPPTGGLGMGVDRIVMLITGGSIRESLAFPFAKPRN- 1150 [Frankia YRLLVGRDTGPRLPTLLLAVGPERIRTLLAATAE- 625 [Streptomyces YHLLVGRDTGPRLPTLLLAVGQDRVRTLLGE 580

De esta forma vemos los aminoácidos conservados. Para saber, si es o no esencial para mi microorganismo ese gen, se ha elegido un aminoácido conservado, la Leucina de la posición 997. La Leucina es un aminoácido aminoácido hidrofobico. Estos aminoácidos son menos solubles en el agua que los aminoácidos con grupos R polares. Si se hace una mutación y cambio la T por una A, obtengo un aminoácido hidrofílico, glutamina: CAG

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-family: 'Courier New';">PRIMER 1: __GAATTC__ atgcctccatcttcctccttg

<span style="background-color: rgb(0, 255, 255); font-family: 'Courier New';">PRIMER 2 Mut1: <span style="background-color: rgb(0, 255, 255); font-family: 'Times New Roman';"> cctcga <span style="background-color: rgb(0, 255, 255); font-family: 'Courier New';">ggtg <span style="background-color: rgb(0, 255, 0); font-family: 'Courier New';">CAG <span style="background-color: rgb(0, 255, 255); font-family: 'Courier New';">cagaagttg Tm=59ºC

<span style="background-color: rgb(255, 0, 255); font-family: 'Courier New';">PRIMER3:mut2:tcgaggcaacttctg <span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-family: 'Courier New';">CTG <span style="background-color: rgb(255, 0, 255); font-family: 'Courier New';">cacc Tm=59ºC

<span style="background-color: rgb(0, 255, 0); font-family: 'Courier New';">PRIMER 4: __GAATTC tca__gttgcgcggcttggcg **DISEÑO DE PRIMERS PARA REALIZAR FUSIONES GÉNICAS ENTRE LA PROTEÍNA DE INTERÉS CON LA PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE PARA ESTUDIAR SU LOCALIZACIÓN CELULAR O SU CONCENTRACIÓN A LO LARGO DEL CRECIEMIENTO DEL MICROORGANISMO** Para localizar nuestra proteína necesitamos hacer primers para crear una proteína de fusión con la proteína fluorescente verde o también podemos meterlo en el plásmido pGFPuv. Los primers son los siguientes; <span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-family: 'Courier New';">Primer1: GAATTC <span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-family: 'Courier New';">atgcctccatcttcctccttg Tm= 60ºC <span style="background-color: rgb(255, 0, 255); font-family: 'Courier New';">Primer 2: <span style="background-color: rgb(255, 0, 255); font-family: 'Times New Roman';"> cttctcctttactcat gttgcgcggcttg Tm:63ºC <span style="background-color: rgb(0, 255, 255); font-family: 'Courier New';">Primer 3: <span style="background-color: rgb(0, 255, 255); font-family: 'Times New Roman';"> gccgcgcaac atgagttaaaggagaagaac Tm=63ºC <span style="background-color: rgb(0, 255, 0); font-family: 'Courier New';">Primer 4: GAATTC <span style="background-color: rgb(0, 255, 0); font-family: 'Times New Roman';"> ttatttgtatag ttc atccatg ccatg tg Tm=60ºC El plásmido de fusión pGFPuv utilizado es el siguiente: