Rafael+Bayarri

= Trabajo final de ingeniería genética de microorganismosCaracterización de la secuencia 4 del cromosoma de Rhodoccocus sp. = **R.Bayarri Olmos**

Trabajo elaborado, poca bibliografía, la ORF elegida no es correcta 

En el presente trabajo se estudió una secuencia determinada de 17.000 pb del genoma de Rhodoccocus (los nombres de especies se subrayan o se escriben en cursiva)  sp., y la caracterización de una de las proteínas codificadas en esa región. Tras esto, se realizó una mutación dirigida y la fusión a la proteína GFP, así como a un tag para facilitar su identificación.
 * RESUMEN**

El nombre del género //Rhodococcus// fue propuesto Goodfellow y Alderson (1) en un estudio de clasificación por taxonomía numérica. //R. rhodochrous// fue propuesto como la especie tipo. El género lo integran además ocho especies: //R. bronchialis, R. coprophilus, R. corallinus, R. erythropolis, R. equi, R. rhodnii, R. ruber, R. rubropertinctus y R. terrae//. Estas bacterias exhiben un amplio rango de actividades metabólicas (2). Tras un análisis bioinformático, fuimos descartando especies,hasta identificar nuestro microorganismo como R. sp.
 * INTRODUCCIÓN**

En este estudio hemos utilizado cepas de Rhodoccocus que crecimos a 28º en caldo de soja, en caldo de agar, o en "minimal salts thiamine medim",y cepas de E.Coli  crecidas a 37ºC en caldo de Luria o en agar de luria. Para realizar las mutaciones de nuestro gen, utilizamos el plásmido pBL1 (referencia) al que introducimos el gen kan para seleccionar las colonias transformantes (pULRS6).(referencia) Obtuvimos la cepa a partir de la toma de un elevado número de muestras de suelo el cauce del río bernesga (Bernesga) , y realizamos la selección en un medio sólido con vapores de una mezcla de hidrocarburos (si no dice algo en la introducción, no se entiende porque ha preparado ese medio)  (hexano, heptano e iso-octano). Para el aislamiento se utilizó un medio con la siguiente composición: sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro cálcico 0,02 g, fosfato monopotásico 1 g, fosfato dipotásico 1 g, nitrato amónico 1 g, cloruro férrico 0,05 g, agar-agar 15 g, y atmósfera de hexano:heptano:iso-octano (1:1:1) en bolsas de polipropileno herméticamente selladas. Con suficiente cantidad de oxígeno para desarrollo aeróbico (aproximadamente 200 ml).
 * MATERIALES Y MÉTODOS**
 * Cepas bacterianas y plásmidos**
 * Obtención y cultivo de la cepa**
 * Análisis de datos** Hemos llevado a cabo un seguimiento bioinformático de todas las etapas de nuestro experimento. Los diferentes programas utilizados serán explicados en sus correspondientes apartados.

PROCEDIMIENTO
La primera parte de nuestra investigación, consistió en idetificar la posición ocupada por nuestro microorganismo en árbol filogenético. Primero aislamos el ADN tratando primro la pared con lisozima y SDS. A continuación, disociamos las proteínas del ADN con proteasas y agentEs coatrópics, procurando de no dañar nuestro ADN. Después de elimiar las proteínas y el ARN, concentramos el ADN. A continuación, tomamos varias muestras del genoma de nuestro microorganismo, y realizamos PCR para coseguir sondas de ADN. Con estas, utilizamos un microarray de ARNr de una gran variedad de microorganismos, con lo que conseguimos identificar el nuestro como Rhodoccocus sp. y establecer lasdistancias genéticas con las demás especies. (esto no se entiende, y no parece tenerlo claro)

2.- Análisis informático de la secuencia mediante el programa ARTEMIS
Una vez identificada la posición filogenética ocupada por nuestro organismo, procedimos a analizar nuestra secuencia de 17.000 pb. Comenzamos localizando los distintos ORFs con el programa Artemis, y analizándolos uno por uno mediante el programa blast del NCBI. Los resultados fueron los siguientes: 45 ORFs en la cadena directa y 39 en la cadena inversa. De todos ellos, los siguientes tenían un prodecto génico identificado:

ORF 1 Localización (en bases): 2-3049 Codifica para: Glutamato sintasa subunidad grande y subunidad beta

ORF 2 Localización: 3773-4702 Codifica para: Subunidad pequeña de la glutamato sintasa

ORF 3 Localización: 12062-12937 Codifica para: Proteína hipotética

ORF 4 Localización: 12938-13741 Codifica para: Deshidogenasa putativa de unión al FAD /proteína hipotética

ORF 5 Localización: 12221-14437 en la cadena inversa Codifica para: Un regulador transcripcional putativo de la familia TetR

ORF 6 Localización: 13949-14359 Codifica para: Regulador trascripcional en el microorganismo Saccharopolyspora erythraea Este último ORF lo he tenido en cuenta debido a lo curioso de esa región, ya que presenta una gran homología con el gen de Saccharopolyspora pero, sin embargo, el programa blast no le encontró similitudes con ninguna región de Rhodoccocus.

De todos estos ORFs, seleccionamos el gen que puede codificar para la __Deshidogenasa putativa de unión al FAD__ o para una __proteína hipotética__. ORF 4: Score = 606 bits (328), Expect = 2e-170 Identities = 668/825 (80%), Gaps = 51/825 (6%) Strand=Plus/Minus


 * Secuencia de nucleótidos en formato FASTA:**

GCGCTTTCCGGTGGCGTCGAGCCACAGCGACGACGGGCCGGGGATGATCCGGATGGCGTG ATCGGGCCAGATCGGGTCCCAGTTGACGATGCCCTCGGTGTAGTGCCACATGCGATCCCG GTTGACGATGTTGCCGCCCGCGTTCTCGGTGATCTCGAGCATGCGGCCGTCCACGTGCGC GGGCACGCCGGTGATCATGTGCTCGGGCACACGGCCCAGGCGGTCGACGGGCCAGTTCTT CTTCACGAGGTCGGGGTTGCCGCCGATGCCGCCGGAGGTCACCACCACGGCCTGCGCGCG GAGTTCGAACTCGCCGACGGGCGTGCGGGACGACTTCACGCCGCGCGGTTCGGTCGACGG CTCGAGCACCGTGCCGCGCACCCCCACGGCGGCGCCGTTCTCGACGATCAGATCGTCCAC CTGGTGCCGGTATCGGAAGGTGACCTGTCCGCGGGCGGCGGCGTCGAGCACCGGTTCGCG GAACACCCGGACCACTTCCGGTCCCGTGCCCCACGTGATGTGGAAGCGCGGTACCGAATT TCCGTGACCGGTGGCCAGCCCACCGCCGCGTTCGGCCCAGCCGACGTTCGGCATCACGCG CAGGCCGAGGTCGTGCAGGTAGGCCCGCTTCTCGCCGGCCGCGAAGTCGACGTAGGCCTC GGCCCACTGCCGGGGCCAACGGTCTTCGCGGTCGCGGTCGAATCCGGCGCTGCCCAGCCA GTCCTGCAGCGCCAGTTCACGGGAGTCCTTGATGCCCATGCGGCGCTGCTCGGGGCTGTC CACCAGGAACAGGCCGCCGAGTGA
 * Secuencia de aminoácidos en formato FASTA:**

Esta ORF no está bien analizada. REQ530

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">ALSGGVEPQRRRAGDDPDGVIG PDRVPVDDALGVVPHAIPVDDVAARVLGDLEHAAVHVR GHAGDHVLGHTAQAVDGPVLLHEVGVAADAAGGHHHGLRAEFELADGRAGRLHAARFGRR LEHRAAHPHGGAVLDDQIVHLVPVSEGDLSAGGGVEHRFAEHPDHFRSRAPRDVEARYRI SVTGGQPTAAFGPADVRHHAQAEVVQVGPLLAGREVDVGLGPLPGPTVFAVAVESGAAQP VLQRQFTGVLDAHAALLGAVHQEQAAE

Diseño de primers para la amplificación del gen/es por PCR
Realizamos los primers "manualmente" y luego comprobamos su validez mediante el programa Primer3 :
 * Primer izquierdo** 5'-GCGCTTTCCGGTGGCGTC-3'


 * Primer derecho** 5'- TCACTCGGCGGCCTGTTCCT -3'

Al probarlos con el PRIMER3, nos dá un aviso de que no es recomendable el uso de estos 2 primers debido a que possen Tm demasiado altas y que el primer izq. tiene una alta estabilidad 3'. Después de probar todos los tamaños de primers posibles para amplificar la totalidad de la secuencia, escogimos la pareja con una Tm menor y más parecida y que no presentase complementariedad de bases.

Tamaño de la secuencia: 804 pb Tamaño incluído entre los primers: 804pb Complementariedad entre primers: 4.00 Complementariedad del extremo 3': 0.00
 * Oligo || Comienzo || Longitud || Tm || %G+C || Auto complementariedad || 3' || Secuencia ||
 * Primer izquierdo || 1 || 18 || 69.68 || 72.22 || 4.00 || 2.00 || GCGCTTTCCGGTGGCGTC ||
 * Primer derecho || 804 || 20 || 69.75 || 69.75 || 5.00 || 0.00 || TCACTCGGCGGCCTGTTCCT ||

Si queremos estudiar el gen, podemos crear primers que incluyan puntos de corte para enzimas de restricción que también corten en el plásmido, de firma que lo podamos introducir y ver como se expresa en nuestro microorganismo: Primer izquierdo: 5'- CCC<span style="color: rgb(255, 0, 0);">AAGCTT GGG GCGCTTTCCGGTGGCGTC (HindIlI) Primer derecho: 5'- CCC<span style="color: rgb(255, 0, 0);">AAGCTT GGG TCACTCGGCGGCCTGTTCCT (HindIlI) La enzima que reconoce la diana añadida al primer, no corta en el interior de nuestra secuencia, pero sí en el plásmido utilizado (pUL340, un vector de clonación en Corinebacterias).

Diseño de primers para amplificar fragmentos internos del gen/es y comprobar si dicho gen/es son esenciales o no para el microorganismo.
Volvemos a utilizar el programa Primer3 para diseñar primers, esta vez, que peritan amplifica secuencias internas:

Tamaño amplificado: 214 pb Esta es la pareja más favorable. El programa, además, te calcula otros primers que también pueden ser usados para amplificr fagmentos internos, pero de diferente tamaño. Por ejemplo: Tamaño amplificado: 186 pb
 * Oligo || Comienzo || Longitud || Tm || %G+C || Auto complementariedad || 3' || Secuencia ||
 * Primer izquierdo || 230 || 20 || 58.99 || 55.00 || 4.00 || 2.00 || GGCCAGTTCTTCTTCACGAG ||
 * Primer derecho || 448 || 20 || 58.87 || 55.00 || 7.00 || 2.00 || ACAGGTCACCTTCCGATACC ||
 * Oligo || Comienzo || Longitud || Tm || %G+C || Auto complementariedad || 3' || Secuencia ||
 * Primer izquierdo || 69 || 19 || 59.91 || 57.89 || 5.00 || 2.00 || AGATCGGGTCCCAGTTGAC ||
 * Primer derecho || 254 || 20 || 58.84 || 55.00 || 4.00 || 0.00 || CCGACCTCGTGAAGAAGAAC ||

Búsqueda informática de promotores, terminadores, secuencias señal…
Valiéndonos de distintas herramientas bioinformáticas, facilitadas por la Queen's university, analizamos la secuencia de nuestro gen, obteniendo la siguiente información:


 * Promotores**

Tuvimos que disminuir manualmente la precisión del análisis, y escogimos un valor límite de 69, ya que a partir de él, se producía una caída drástica de la puntuación de los posibles promotores. El programa utilizado fue el PromScan. Al cotejar los resultados con el programa BProm de Softberry, en el cual no te deja ajustar su precisión y especifidad (por defecto, el 80%), no encontramos promotores. De todos ellos, nos quedaríamos con el promotor de la primera posición (9), y a lo sumo, con el que ocupa la posicion 173. <span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">Debería haber señalado en la secuencia dónde se encuentra el promotor
 * Score || Description ||
 * || 72 ||  || **Position:** || 9 ||
 * **Strand:** || + ||
 * **Sequence:** || GTGGCGTGCGCTTTCCG ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 72 ||  || **Position:** || 494 ||
 * **Strand:** || - ||
 * **Sequence:** || GTGGTCCGGGTGTTCCG ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 71 ||  || **Position:** || 173 ||
 * **Strand:** || - ||
 * **Sequence:** || GTGGACGGCCGCATGCT ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 71 ||  || **Position:** || 635 ||
 * **Strand:** || + ||
 * **Sequence:** || TAGGCCCGCTTCTCGCC ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 70 ||  || **Position:** || 536 ||
 * **Strand:** || - ||
 * **Sequence:** || TCGGTACCGCGCTTCCA ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 69 ||  || **Position:** || 234 ||
 * **Strand:** || - ||
 * **Sequence:** || CTGGCCCGTCGACCGCC ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 69 ||  || **Position:** || 376 ||
 * **Strand:** || - ||
 * **Sequence:** || GCGGCACGGTGCTCGAG ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||
 * 69 ||  || **Position:** || 616 ||
 * **Strand:** || + ||
 * **Sequence:** || CAGGCCGAGGTCGTGCA ||
 * **Locus:** || 1 ||  ||


 * Terminadores**

Para al búsqueda bioinformática de terminadores, utilizamos el programa TransTermHP, que realiza predicciones sobre la localización de terminadores en los microorganismos de su base de datos. Debido a que el genoma de Rhodococcus no está disponible para realizar el estudio de terminadores <span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">(eso no es una excusa, el terminador se encuentra en la secuencia que le he proporcionado, o no ha entendido el concepto ), utilizamos el microorganismo más próximo fiogeneticamente, Nocardia farcinina y utilizamos sus datos. Debido a que no disponíamos de mejores herramientas, tuvimos que realizar la búsqueda manual de los terminadores en la secuencia pra nuestra proteína, pero no obtuvimos ningún resultado favorable.

Diseño de primers para amplificar los genes que codifican para la proteína de interés con colas de histidina para su rápida purificación
Introduciremos nuestro Tag en el extremo 5' de la proteína:

Primer izquierdo: 5'- CCC<span style="color: rgb(255, 0, 0);">AAGCTT GGG ATG <span style="color: rgb(0, 0, 255);">CGCCGCCGCCGCCGCCGC GCGCTTTCCGGTGGCGTC Primer derecho: 5'- CCC<span style="color: rgb(255, 0, 0);">AAGCTT GGG TCACTCGGCGGCCTGTTCCT

En el primer izquierdo hemos introducido el codón de inicio antes de la secuencia que codifica para His6 (una cola de 6 residuos de histidina), en color azul. Para el primer derecho hemos respetado su estructura, sin añadirle ningún codón de terminación, pues ya viene en nuestra proteína. Hemos utilizado las sec. diana de la enzima HindIII, que sólo posee un sitio de corte en el plásmido (lugar en el que se insertará nuestra construcción), por lo que podremos hacer un screening rápido de nuestro gen.

Características fisico-químicas
__Número de aminoácidos:__ 267 __Peso molecular:__ 27668.7 __PI:__ 5.82 __Composición de aminoácidos__: Ala (A) 43 16.1% Arg (R) 22 8.2% Asn (N) 0 0.0% Asp (D) 21 7.9% Cys (C) 0 0.0% Gln (Q) 11 4.1% Glu (E) 15 5.6% Gly (G) 35 13.1% His (H) 22 8.2% Ile (I) 4 1.5% Leu (L) 22 8.2% Lys (K) 0 0.0% Met (M) 0 0.0% Phe (F) 7 2.6% Pro (P) 18 6.7% Ser (S) 6 2.2% Thr (T) 5 1.9% Trp (W) 0 0.0% Tyr (Y) 1 0.4% Val (V) 35 13.1% Pyl (O) 0 0.0% Sec (U) 0 0.0%

(B) 0 0.0% (Z) 0 0.0% (X) 0 0.0%

__Número total de residuos cargados negativamente (Asp+Glu):__ 36 __Número total de residuos cargados positivamente (Arg+Lys):__ 22

__Composición atómica:__ Carbon C 1208 Hydrogen H 1902 Nitrogen N 388 Oxygen O 363 Sulfur S 0

__Coeficiente de extinción:__ 1490 (medido a 280nm en agua). Esta proteína no contiene residuos Trp, lo que puede llevar a un error de más del 10% en el cálculo del coeficiente de extinción (M-1 cm-1). Abs 0.1% (=1 g/l) 0.054, assuming ALL Cys residues appear as half cystines

__Vida media estimada:__ 4.4 horas (reticulocitos in vitro). >20 horas (levaduras, in vivo). >10 horas (Escherichia coli, in vivo).

__Índice de inestabilidad:__ 25.50 Con este valor, consideramos la proteína como estable.

__Índice alifático:__ 92.10

Motivos de la proteína<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);"> (despues de todo esto, qué conclusión saca de esta proteína?)
El programa motifScan nos permite acceder a distintas bases de datos desde las que identificar los diferentes motivos de nuestra proteína. Los distintos motivos quedan recogidos en el siguiente mapa: A continuación, se encuentra una vista más detallada de los mismos. El orden se corresponde con el mostrado en el mapa.

Hidrofobicidad
Para calcular este parámetro, utilizamos el programa Protscale., el cual te permite calclar y representar el perfil producido por cualquier "escala de aminoácidos" en la proteína seleccionada. Una escala de aminoácido se define por un valor numérico asignado a cada aminoácido. En nuestro caso, utilizamos la escala de hidrofobicidad de Kyte & Doolittle. Los valores de los aminoácidos son los que siguen: code Ala: 1.800  Arg: -4.500  Asn: -3.500  Asp: -3.500  Cys:  2.500  Gln: -3.500 Glu: -3.500 Gly: -0.400  His: -3.200  Ile:  4.500  Leu:  3.800  Lys: -3.900 Met: 1.900  Phe:  2.800  Pro: -1.600  Ser: -0.800  Thr: -0.700  Trp: -0.900 Tyr: -1.300 Val:  4.200  : -3.500  : -3.500  : -0.490

code Reprentación de la escala de hidrofobicidad de Kyte & Doolittle:

Familia
Según de que fuente obtengamos la secuencia, el programa Pfam nos da un resultado u otro. Con la secuancia de aminoácidos obtenida con el ARTEMIS, el Pfam no encuentra ninguna familia <span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">(eso es la prueba de que no ha utilizado bien Arttemis y ha elegido un ORF no correcto). Si tomamos el prouct génico desde lso resultados del ncbi, obtenemos que pertenece a la "FAD binding domain". Esta familia incluye las subunidades flavoproteina de las fumarato y succinato deshidrogenasa, aspartato oxidasa y la subunidad alfa de la adenililsulfato reductasa. En bacterias hay 2 grupos diferenciados; proteínas unidas a membrana y complejos enzimaticos responsables de la interconversión de fumarato y succinato: fumarato reductasa (Frd), usada en el crecimiento anaeróbico, y la succinato deshidrogenasa (Sdh), usada en el crecimiento aeróbico. Ambos complejos están formados por dos componentes principales: un componente extrínseco de membrana, compuesto por una flavoproteína de unión al FAD y un proteína de hierro-azufre; y un componente hidrofóbico compuesto de una proteína de anclaje a la membrana y/o un citocromo B. La subunidad flavoproteína es una proteina de unos 60 a 70 kd, en la cual el FADestá unido covalentmente a un residuo de histidina localizado en la sección N-terminal de la proteína [|PUBMED:2668268].La secuencia de los alrededores de la histidina esá bien conservada en Frd y Sdh en numerosas especias bacterianas y eucariotas [|PUBMED:1375942]. Esta familia es miembro del clan **[|NADP_Rossmann]** ([|CL0063]).

Localización celular
Para localizar nuestra proteína utilizamos el programa PsortB, obteniendo que es una proteína citoplasmática: Localization Scores: __Cytoplasmic 8.87__ CytoplasmicMembrane 0.39 Cellwall 0.01 Extracellular 0.73 Debido a sólo ha podido encontrar unas pocas regiones identificativas de la posición en nuestra secuencia, comprobaremos los resultados buscando posibles péptidos señal y dominios trasmembrana:


 * Péptido señal**

El análisis lo hemos realizado online con el Signal 3.0. La primer gráfica corresponde a un análisis de "neural networks" (NN), y la segunda a "hidden Markov models" (HMM):


 * Dominios transmembrana**

Como podíamos esperar, después de realizar el análisis, comprobamos que no posee dominios transmembrana, por lo que afirmamos que se trata de una proteína citoplasmática.

Mutagénesis in vitro del gen que codifica para la proteína elegida.
<span style="font-size: 8.5pt; color: blue; line-height: 115%; font-family: 'Times New Roman','serif';">GCGCTTTCCGGTGGCGTC <span style="font-size: 8.5pt; color: black; line-height: 115%; font-family: 'Times New Roman','serif';">GAGCCACAGCGACGACGGGCCGGGGATGATCCGGATGGCGTG <span style="font-size: 6pt; color: black; line-height: 115%; font-family: 'Times New Roman','serif';"> <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CGCGAAAGGCCACCGCAGCTCGGTGTCGCTGCTGCCCGGCCCCTACTAGGCCTACCGCAC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">ATCGGGCCAGATCGGGTCCCAGTTGACGATGCCCTCGGTGTAGTGCCACATGCGATCCCG TAGCCCGGTCTAGCCCAGGGTCAACTGCTACGGGAGCCACATCACGGTGTACGCTAGGGC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GTTGACGATGTTGCCGCCCGCGTTCTCGGTGATCTCGAGCATGCGGCCGTCCACGTGCGC CAACTGCTACAACGGCGGGCGCAAGAGCCACTAGAGCTCGTACGCCGGCAGGTGCACGCG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GGGCACGCCGGTGATCATGTGCTCGGGCACACGGCCCAGGCGGTCGACG GGCCA**GTT**CTT CCCGTGCGGCCACTAGTACACGAGCCCGTGTGCCGGGTCCGCCAGCTGC<span style="color: rgb(0, 176, 80);">CCGGT**CAA**GAA <span style="font-size: 8.5pt; color: red; font-family: 'Times New Roman','serif';">CTTCACGAG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GTCGGGGTTGCCGCCGATGCCGCCGGAGGTCACCACCACGGCCTGCGCGCG <span style="font-size: 8.5pt; color: rgb(0, 176, 80); font-family: 'Times New Roman','serif';">GAAGTGCTC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CAGCCCCAACGGCGGCTACGGCGGCCTCCAGTGGTGGTGCCGGACGCGCGC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GAGTTCGAACTCGCCGACGGGCGTGCGGGACGACTTCACGCCGCGCGGTTCGGTCGACGG CTCAAGCTTGAGCGGCTGCCCGCACGCCCTGCTGAAGTGCGGCGCGCCAAGCCAGCTGCC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CTCGAGCACCGTGCCGCGCACCCCCACGGCGGCGCCGTTCTCGACGATCAGATCGTCCAC GAGCTCGTGGCACGGCGCGTGGGGGTGCCGCCGCGGCAAGAGCTGCTAGTCTAGCAGGTG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CTGGTGCCGGTATCGGAAGGTGACCTGTCCGCGGGCGGCGGCGTCGAGCACCGGTTCGCG GACCACGG<span style="color: rgb(0, 0, 0);">CCATAGCCTTCCACTGGACA GGCGCCCGCCGCCGCAGCTCGTGGCCAAGCGC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GAACACCCGGACCACTTCCGGTCCCGTGCCCCACGTGATGTGGAAGCGCGGTACCGAATT CTTGTGGGCCTGGTGAAGGCCAGGGCACGGGGTGCACTACACCTTCGCGCCATGGCTTAA <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">TCCGTGACCGGTGGCCAGCCCACCGCCGCGTTCGGCCCAGCCGACGTTCGGCATCACGCG AGGCACTGGCCACCGGTCGGGTGGCGGCGCAAGCCGGGTCGGCTGCAAGCCGTAGTGCGC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CAGGCCGAGGTCGTGCAGGTAGGCCCGCTTCTCGCCGGCCGCGAAGTCGACGTAGGCCTC GTCCGGCTCCAGCACGTCCATCCGGGCGAAGAGCGGCCGGCGCTTCAGCTGCATCCGGAG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GGCCCACTGCCGGGGCCAACGGTCTTCGCGGTCGCGGTCGAATCCGGCGCTGCCCAGCCA CCGGGTGACGGCCCCGGTTGCCAGAAGCGCCAGCGCCAGCTTAGGCCGCGACGGGTCGGT <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GTCCTGCAGCGCCAGTTCACGGGAGTCCTTGATGCCCATGCGGCGCTGCTCGGGGCTGTC CAGGACGTCGCGGTCAAGTGCCCTCAGGAACTACGGGTACGCCGCGACGAGCCCCGACAG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CACCAGGAACAGGCCGCCGAGTGA GTGGT CCTTGTCCGGCGGCTCACT <span style="font-size: 12pt; font-family: 'Times New Roman','serif';"> Primer 1: <span style="color: rgb(0, 112, 192);">GCGCTTTCCGGTGGCGTC Primer 2: GGCCA**C**TTCTTCTTCACGAG Primer 3: <span style="color: rgb(0, 176, 80);">CTCGTGAAGAAGAA**G**TGGCC Primer 4: TCACTCGGCGGCCTGTTCCT

<span style="font-size: 12pt; color: rgb(0, 0, 0); font-family: 'Arial','sans-serif';">Realizamos la mutación en el codón GTT, que codifica para el aminoácido alifático Valina, sustituyendo la G por la C, por lo que ahora pasará a codificar para la leucina, otro aminoacido alifático. Hemos realizado una mutación conservativa utilizando primers que presentan "missmatch".

====Diseño de primers para realizar fusiones génicas entre la proteína de interés con la proteína fluorescente verde para estudiar su localización celular o su concentración a lo largo del crecimiento del microorganismo.====

<span style="font-size: 8.5pt; color: blue; line-height: 115%; font-family: 'Times New Roman','serif';">GCGCTTTCCGGTGGCGTC <span style="font-size: 8.5pt; color: black; line-height: 115%; font-family: 'Times New Roman','serif';">GAGCCACAGCGACGACGGGCCGGGGATGATCCGGATGGCGTG <span style="font-size: 6pt; color: black; line-height: 115%; font-family: 'Times New Roman','serif';"> <span style="color: rgb(0, 0, 0);"><span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CGCGAAAGGCCACCGCAGCTCGGTGTCGCTGCTGCCCGGCCCCTACTAGGCCTACCGCAC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">ATCGGGCCAGATCGGGTCCCAGTTGACGATGCCCTCGGTGTAGTGCCACATGCGATCCCG TAGCCCGGTCTAGCCCAGGGTCAACTGCTACGGGAGCCACATCACGGTGTACGCTAGGGC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GTTGACGATGTTGCCGCCCGCGTTCTCGGTGATCTCGAGCATGCGGCCGTCCACGTGCGC CAACTGCTACAACGGCGGGCGCAAGAGCCACTAGAGCTCGTACGCCGGCAGGTGCACGCG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GGGCACGCCGGTGATCATGTGCTCGGGCACACGGCCCAGGCGGTCGACG<span style="color: rgb(0, 0, 0);">GGCCAGTTCTT CCCGTGCGGCCACTAGTACACGAGCCCGTGTGCCGGGTCCGCCAGCTGC<span style="color: rgb(0, 0, 0);">CCGGTCAAGAA <span style="font-size: 8.5pt; color: rgb(0, 0, 0); font-family: 'Times New Roman',Times,serif;">CTTCACGAG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GTCGGGGTTGCCGCCGATGCCGCCGGAGGTCACCACCACGGCCTGCGCGCG <span style="font-size: 8.5pt; color: rgb(0, 0, 0); font-family: 'Times New Roman',Times,serif;">GAAGTGCTC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CAGCCCCAACGGCGGCTACGGCGGCCTCCAGTGGTGGTGCCGGACGCGCGC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GAGTTCGAACTCGCCGACGGGCGTGCGGGACGACTTCACGCCGCGCGGTTCGGTCGACGG CTCAAGCTTGAGCGGCTGCCCGCACGCCCTGCTGAAGTGCGGCGCGCCAAGCCAGCTGCC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CTCGAGCACCGTGCCGCGCACCCCCACGGCGGCGCCGTTCTCGACGATCAGATCGTCCAC GAGCTCGTGGCACGGCGCGTGGGGGTGCCGCCGCGGCAAGAGCTGCTAGTCTAGCAGGTG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CTGGTGCCGGTATCGGAAGGTGACCTGTCCGCGGGCGGCGGCGTCGAGCACCGGTTCGCG GACCACGG<span style="color: rgb(0, 0, 0);">CCATAGCCTTCCACTGGACA GGCGCCCGCCGCCGCAGCTCGTGGCCAAGCGC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GAACACCCGGACCACTTCCGGTCCCGTGCCCCACGTGATGTGGAAGCGCGGTACCGAATT CTTGTGGGCCTGGTGAAGGCCAGGGCACGGGGTGCACTACACCTTCGCGCCATGGCTTAA <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">TCCGTGACCGGTGGCCAGCCCACCGCCGCGTTCGGCCCAGCCGACGTTCGGCATCACGCG AGGCACTGGCCACCGGTCGGGTGGCGGCGCAAGCCGGGTCGGCTGCAAGCCGTAGTGCGC <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">CAGGCCGAGGTCGTGCAGGTAGGCCCGCTTCTCGCCGGCCGCGAAGTCGACGTAGGCCTC GTCCGGCTCCAGCACGTCCATCCGGGCGAAGAGCGGCCGGCGCTTCAGCTGCATCCGGAG <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GGCCCACTGCCGGGGCCAACGGTCTTCGCGGTCGCGGTCGAATCCGGCGCTGCCCAGCCA CCGGGTGACGGCCCCGGTTGCCAGAAGCGCCAGCGCCAGCTTAGGCCGCGACGGGTCGGT <span style="font-size: 8.5pt; font-family: 'Times New Roman','serif';">GTCCTGCAGCGCCAGTTCACGGGAGTCCTTGATGCCCATGCGGCGCTGCTCGGGGCTGTC CAGGACGTCGCGGTCAAGTGCCCTCAGGAACTACGGGTACGCCGCGACGAGCCCCGACAG <span style="font-size: 70%; color: rgb(0, 0, 0);">CACCAGGAACA<span style="color: rgb(255, 0, 0);">GGCCGCCGAG<span style="color: rgb(0, 0, 0);">TGA GTGGT<span style="color: rgb(0, 0, 0);">CCTTGT<span style="color: rgb(255, 0, 255);">CCGGCGGCTC ACT  <span style="font-size: 12pt; font-family: 'Times New Roman','serif';"><span style="color: rgb(0, 0, 0);">

<span style="font-size: 8.5pt; color: rgb(0, 0, 0);"> Secuencia del gen GFP <span style="font-family: 'Arial','sans-serif';"> <span style="font-size: 8.5pt; color: red; font-family: 'Arial','sans-serif';">ATGAGTAAAGGAG<span style="font-size: 8.5pt; color: black; font-family: 'Arial','sans-serif';">AAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATG 0 <span style="font-size: 8.5pt; color: rgb(112, 48, 160); font-family: 'Arial','sans-serif';">TACTCATTTCCTC <span style="font-size: 8.5pt; color: black; font-family: 'Arial','sans-serif';">TTCTTGAAAAGTGACCTCAACAGGGTTAAGAACAACTTAATCTACCACTACAATTAC 0

GGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTAT 70 CCGTGTTTAAAAGACAGTCACCTCTCCCACTTCCACTACGTTGTATGCCTTTTGAATGGGAATTTAAATA 70

TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCGGTTATGGTGTTCAATGC 140 AACGTGATGACCTTTTGATGGACAAGGTACCGGTTGTGAACAGTGATGAAAGCCAATACCACAAGTTACG 140

TTTGCGAGATACCCAGATCATATGAAACAGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCTGAAGGTTATGTAC 210 AAACGCTCTATGGGTCTAGTATACTTTGTCGTACTGAAAAAGTTCTCACGGTACGGACTTCCAATACATG 210

AGGAAAGAACTATATTTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGA 280 TCCTTTCTTGATATAAAAAGTTTCTACTGCCCTTGATGTTCTGTGCACGACTTCAGTTCAAACTTCCACT 280

TACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTTGGACACAAA 350 ATGGGAACAATTATCTTAGCTCAATTTTCCATAACTAAAATTTCTTCTACCTTTGTAAGAACCTGTGTTT 350

TTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGTTA 420 AACCTTATGTTGATATTGAGTGTGTTACATATGTAGTACCGTCTGTTTGTTTTCTTACCTTAGTTTCAAT 420

ACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGAAGCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCC 490 TGAAGTTTTAATCTGTGTTGTAACTTCTACCTTCGCAAGTTGATCGTCTGGTAATAGTTGTTTTATGAGG 490

AATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGAT 560 TTAACCGCTACCGGGACAGGAAAATGGTCTGTTGGTAATGGACAGGTGTGTTAGACGGGAAAGCTTTCTA 560

CCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGG 630 GGGTTGCTTTTCTCTCTGGTGTACCAGGAAGAACTCAAACATTGTCGACGACCCTAATGTGTACCGTACC 630

ATGAACTATACAAATAA 717 TACTTGATATGTTTATT 717 <span style="font-size: 8.5pt; color: black; font-family: 'Arial','sans-serif';">

Primer derecho: 5'- CCC<span style="color: rgb(255, 0, 0);">AAGCTT GGG TCACTCGGCGGCCTGTTCCT (HindIlI) Primer 1: 5'- CCC__AAGCTT__GGG ATG <span style="color: rgb(0, 112, 192);">GCGCTTTCCGGTGGCGTC Primer 2: 5'- <span style="color: rgb(255, 0, 255);">CTCCTTTACTCATCTCGGCGGCC Primer 3: 5'- <span style="color: rgb(255, 0, 0);">GGCCGCCGAG<span style="font-size: 12pt; color: rgb(255, 0, 0);">ATGAGTAAAGGAG Primer 4: 5'- AA<span style="color: rgb(0, 0, 0);">__CTGCAG__ AACCAATGCATTGG <span style="color: rgb(255, 255, 0);">AATAAACATATCAAGTAGGTACGG<span style="color: rgb(0, 0, 0);"> (PstI) Nota: Las dianas de las enzimas de restricción se encuentras subrayadas y flanqueadas por las bases necesarias para que se produca el corte.

<span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;"> 1. Goodfellow M, Alderson G (1977) The actinomycete-genus //Rhodococcus//: a home for the '//rhodochrous//' complex. J. Gen. Microbiol. 100: 99-122. 2. Warhurst AM, Fewson CA (1994) Biotransformations catalyzed bythe genus <span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">hodococcus <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">. Crit. Rev. Biotechnol. 14: 29-73.
 * BIBLIOGRAFIA** <span style="background-color: rgb(255, 255, 0); font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;">(no se puede escribir un trabajo en el 2009 usando una bibliografía anticuada) <span style="font-family: Arial,Helvetica,sans-serif;"> No ha utilizado los programas indicados para la bibliografía.