Raquel+Alvarez

Raquel Álvarez.
 * Análisis bioinformático, detección y mutación de la proteína de unión a penicilina PbpA en //Rhodococcus// sp. **

Trabajo bien elaborado, referencias escasas pero bien utilizadas, análisis de Artemis casi correcto, pero ha usado una secuencia de otro microorganismo para hacer el trabajo.

Las bacterias pertenecientes al género //Rhodococcus// son Gram positivas con alto contenido en G+C y aerobios. En este trabajo se han analizado 17000 pares de bases pertenecientes al genoma de //Rhodococcus// sp., eligiendo una proteína perteneciente a la familia de las trasnpeptidasas, la Penicillin-binding protein PbpA, para su análisis. Se realizó un análisis bioinformático para conocer sus características morfológicas y fisicoquímicas, así como también se llevo a cabo una inactivación del gen y una mutagénesis para comprobar como la actividad de la proteína influía en el fenotipo de //Rhodococcus// sp. Posteriormente se realizó una purificación y una fusión con la proteína fluorescente verde para su localización en la membrana plasmática de la célula.
 * RESUMEN**

Las bacterias pertenecientes al género //Rhodococcus// son Gram positivas con alto contenido en G+C y aerobios. Presentan una amplia diversidad metabólica, sobre todo a los compuestos hidrófobos, como los hidrocarburos clorados, compuestos fenólicos, esteroides, lignina, carbón y petróleo (Finnerty, 1992). Es un grupo muy diverso de bacterias que posee la capacidad de degradar una gran cantidad de compuestos orgánicos. Los usos de //Rhodococcus// incluyen la producción esteroides bioactivos, la biodesulfurización del combustible fósil, y la producción de la acrilamida y del ácido de acrílico. (Larkin, Kulakov, & Allen, 2005). Algunos miembros del género //Rhodococcus// son conocidos agentes patógenos para los seres humanos, animales y plantas, aunque la mayor parte de las especies que pertenecen a este género no son patógenas.
 * INTRODUCCIÓN**

Clasificación: Reino: Bacteria Filo: Actinobacteria Orden: Actinomycetales Suborden: Corynebacterineae Familia: Nocardiaceae Género: //Rhodococcus//

El trabajo está centrado en una proteína concreta, la Penicillin-binding protein PbpA (o proteína de unión a la penicilina A). **Fig.1** Existen numerosas PBPs diferentes y son habitualmente específicas de cada especie. Son proteínas situadas en la membrana plasmática de la bacteria e intervienen en la formación de la pared celular. La PbpA pertenece al grupo de PBP’s de alto peso molecular, tiene actividad transpeptidasa y actúan en la última fase de la formación del peptidoglycano (Murray, Popham, & Setlow, 1997). Forma un enlace peptídico entre dos D-ala de dos polímeros distintos de peptidoglycano formados en fases anteriores. Las PBP’s intervienen en la formación de la pared y por lo tanto en el crecimiento de la bacteria y en la conformación de la estructura (Wada & Watanabe, 1998). El nombre de proteína de unión a penicilina (PBP) es debido a que estas enzimas son el sitio de acción de las penicilinas (y otros antibióticos ß-lactámicos) y las bloquean debido a que el anillo β- lactámico tiene una estructura espacial similar a la del residuo acil-D-alanin-D-alanina de las cadenas del peptidoglicano, que es el sustrato natural de las PBP (Zapun, Contreras-Martel, & Vernet, 2008).
 * Penicillin-binding protein PbpA**

Penicillin-binding protein PbpA se encuentra entre los nucleótidos 3810204 al 3811691 de la cadena complementaria del genoma de //Rhodococcus// sp//.,// tiene una longitud total de 1.49kb que codifican para un péptido de 495 aminoácidos **(ver Anexo 1).**
 * __Análisis Bioinformático de PbpA__**

Las características fisico-químicas de la proteína fueron analizadas bioinformáticamente mediante [|ProtParam]. **(ver Anexo 2)** Como anteriormente se ha comentado la PBPA está localizada en la membrana plasmática, no obstante se realizo el análisis bioinformático correspondiente prediciendo la situación de la proteína en la célula ([|PSORTb]) y localizando hélices transmembrana en la proteína ([|TMHMM]). También se buscó la presencia de péptido líder mediante [|SignalP 3.0 Server]. Los resultados indican que se trata de una proteína localizada en la membrana plasmática, con un dominio transmembrana y el resto de la proteína es extracelular. Por último se verificó la presencia de péptido señal. **(ver Anexo 3).** Penicillin binding protein PBPA presenta un dominio que pertenece a la superfamilia de trasnpeptidasas. Cataliza la reacción que da lugar al enlace peptídico entre dos D-ala (transpeptidación) en la formación del peptidoglycano de la pared celular (Macheboeuf et al., 2005)



Se realizó un análisis bioinformático para saber que familia pertenece la proteína mediante el programa [|Pfam] reafirmando que se trata de un transpeptidasa.

Según los datos obtenidos se trata de un dominio transpeptidasa que comienza en el aminoácido 164 y termina en el 489. Mediante la base de datos de proteínas del [|NBCI] se busco la secuencia de aminoácidos de distintas especies de bacterias de la proteína PBPA con el fin de hacer un alineamiento y ver las zonas conservadas. Posteriormente se dibujó un árbol filogenético. El sitio activo de la trasnspeptidasa es una serina que está conservada en todos los miembros de esta familia (Joris et al., 1988). (**ver Anexo 4**)


 * MATERIALES Y MÉTODOS**

En el presente trabajo se utilizaron las siguientes cepas: //Rhodococcus// sp. //E.coli// K12 //E.coli// BL21(DE3).
 * · Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.**

Las cepas de //E.coli// son cultivadas en medio Luria-Bertani (LB) (1% triptófano, 0,5% de extracto de levadura y 0,5% de NaCl) a 37ºC. Para la sobreexpresión de genes clonados los cultivos se crecieron en medio rico en triptófano (3,2%), 2% de extracto de levaduray 1% de NaCl. //Rhodococcus// sp//.// es cultivada en medio Brain Heart Infusion (BHI) a 30ºC. Cuando sea necesario, se añadiran los siguientes suplementos en el medio: Ampicilina, kanamicina, e IPTG.

Mediante PCR se amplificó un fragmento de 1172 pb del gen que codifica para la proteína PBPA. Los primers utilizados fueron diseñados por el programa informático [|Primer3].  Está Ud. segura que estos primers amplifican el gen??? Para qué realiza esta amplificación???
 * · Amplificación del gen de interés por PCR.**

Primer Directo: 5’- GCCACCTACGTTCAGGTCAT - 3’ Primer Reverso: 5’- TTGTTCTCGGAACCGATCAT - 3’

La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador programado para realizar una desnaturalización inicial del ADN a 95ºC durante 4 min, seguida de 35 ciclos que comprenden las siguientes etapas: 40 segundos a 93ºC, 40 segundos a 55ºC y 55 segundos a 72ºC. La última extensión se prolongó durante 5 min. El producto de amplificación se visualizó en gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de Etidio

Se realiza una interrupción génica mediante plásmidos suicidas. Para ello es necesario amplificar un fragmento interno del gen y clonarlo en un plásmido que no replicativo en //Rhodococcus.//  La obtención de plasmidos se realizo de igual forma que en el apartado anterior, mediante el programa Primer3.
 * · Comprobación si el gen es esencial o no para el microorganismo.**

Primer Directo: 5’- AACTACAACGGCTCCACCTG – 3’ Primer Reverso: 5’- TTGTTCTCGGAACCGATCAT – 3’

Para poder clonar el fragmento en un plásmido se les añade un sitio de corte en el extremo 5’. En el primer 1 un sitio HindIII y en el primer 2 un sitio BamHI, además de 3 nucleótidos para que el corte sea efectivo. Primer Directo: 5’- CCCA/AGCTT AACTACAACGGCTCCACCTG – 3’ Primer Reverso: 5’- CGCG/GATCC TTGTTCTCGGAACCGATCAT – 3’

Con estos primers se amplifica un fragmento interno de 449 pb que va a ser clonado en un plásmido pUC19 (**Fig.2**) contiene el origen de replicación de //E. coli//, no replicando en //Rhodococcus//, y el gen de resistencia a ampicilina. También incluye el gen //lacZ//, donde se encuentra el sitio de clonación múltiple o polilinker.

El plásmido es insertado en //Rhodococcus// mediante electroporación (Sekizaki et al., 1998). Si lleva el inserto del gen se integrará por recombinación simple en el genoma de //Rhodococcus//, inactivando el gen y produciendo un RNAm no funcional.

La purificación de la proteína se realiza mediante la amplificación del gen que codifica para PBPA con colas de histidina. Los primers utilizados para la amplificación del gen son: Primer 1: 5’- GGAATTCCA/TATG AACACACCGCTGCGCCG – 3’ (NdeI ) Primer 2: 5’- CCCA/AGCTT GCCCCCTTGTAGTCCGGCTG – 3’ (HindIII )
 * · Purificación de la proteína.**

Los productos amplificados se clonan en el plásmido pET-28a(+) (**Fig.3**). [|(Novagen)] pET-28a (+) tiene 5369 pb y contiene el gen resistencia a kanamicina, posee una secuencia aminoterminal que contiene His·Tag/trombina/T7 Tag y una configuración adicional en el C-terminal el cual lleva una cola de histidinas para su purificación. Los genes clonados en el plásmido pET se transcriben bajo el control del promotor del fago T7, cuando se activa la T7 RNA polimerasa en la célula huésped. La expresión se induce con IPTG, el cual remueve al represor del operador para que se lleve a cabo la transcripción y se promueva la expresión de la proteína de interés (Tabor & Richardson, 1985).



El plásmido con el gen de interés se introduce mediante transformación en //E.coli// BL21(DE3) cuyo genoma contiene el gen que codifica para la T7 RNA polimerasa y carece de proteasas. Se seleccionan las cepas trasnformadas añadiendo al medio kanamicina.

La proteína fusionada a colas de histidina se purifica mediante cromatografía de afinidad utilizando resinas que llevan níquel unido a bolas de agarosa. Posteriormente para eliminar las colas de histidina utilizamos la peptidasa trombina, que corta en una serie de aminoácidos que se encuentran entre las histidinas y nuestra proteína. Previamente se comprobó mediante [|PeptideCutter] que la proteína a purificar no es degradada por la trombina.

· **Comprobación de sitios de corte por enzimas de restricción.** Se comprobó mediante el programa [|NEBCutter] que ninguno de los sitios de corte utilizados para la clonación en plásmidos estuviera presentes en la secuencia del gen. **(Fig. 4)

**

Se introduce una mutación puntual en la serina del centro activo, situada en la posición 186 de la secuencia de aminoácidos. Se cambia la serina (AGC) por una prolina (CGC). Primers utilizados: Primer 1: 5’ – ATGAACACACCGCTGCGCCG – 3’ Primer 2: 5’ – GGGATCGTAGC G CGGGGT – 3’ Primer 3: 5’ – ACCCCG C GCTACGATCCC – 3’ Primer 4: 5’ – TCAGCCCCCTTGTAGTCCGG – 3’ · **Localización celular de PBPA mediante la fusión del gen con la proteína fluorescente verde (GFP).** Primers utilizados para la fusión del gen de interés con GFP: Primer 1: 5’ – ATGAACACACCGCTGCGCCG – 3’ Primer 2: 5’ – CTTTACTCAT GCCCCCTTGTAG – 3’ Primer 3: 5’ – TACAAGGGGGC ATGAGTAAAG – 3’ Primer 4: 5’ – TTATTTGTATAGTTCATCCATGC  – 3’
 * · Mutagénesis in vitro del gen que codifica para PBPA.**

 En la amplificación del gen que codifica para la proteína PBPA, se amplificó un fragmento de 1172pb. El producto obtenido se corrió en un gel de agarosa al 1,5%, se tiñó con bromuro de etidio y se observo en luz UV. Se obtuvo una única banda de 1,2kb, comprobando así que el gen que codifica para la proteína de interés está presente en el genoma de la cepa utilizada. (**Fig. 5**)
 * RESULTADOS Y DISCUSIÓN**

Tanto en la inactivación del gen mediante la inserción del plásmido suicida, como en la mutagénesis puntual cambiando un aminoácido del centro activo de la proteína, se obtuvo el mismo resultado. Se comprobó que el gen no es esencial para la vida del microorganismo ya que se obtuvieron colonias recombinantes. No obstante, se visualizaron en microscopio para comprobar si producían cambios en el fenotipo de la bacteria. El resultado fue que presentaban un crecimiento menor y forma casi redondeada, perdiendo la forma bacilar. (**Fig.6**).

Se podían esperar cambios mas pronunciados en el fenotipo ya que la proteína interviene en la síntesis de peptidoglicano y debería ser determinante de la morfología celular. Sin embargo, el fenotipo obtenido no presenta un cambio muy pronunciado debido probablemente al gran número de PBPs y su redundancia funcional (esta frase requiere un explicación y una referencia)



La fusión de PBPA con la proteína fluorescente verde permitió su localización en la célula. Refleja su situación en la membrana plasmática de //Rhodococcus// sp.

**REFRENCIAS**
 * Finnerty, W. R. (1992).** The biology and genetics of the genus //Rhodococcus//. //Annual Review of Microbiology, 46//, 193-218. doi:10.1146/annurev.mi.46.100192.001205


 * Joris, B., Ghuysen, J. M., Dive, G., Renard, A., Dideberg, O., Charlier, P., et al. (1988).** The active-site-serine penicillin-recognizing enzymes as members of the //Streptomyces// R61 DD-peptidase family. //The Biochemical Journal, 250//(2), 313-324.


 * Larkin, M. J., Kulakov, L. A., & Allen, C. C. (2005).** Biodegradation and //Rhodococcus//--masters of catabolic versatility. //Current Opinion in Biotechnology, 16//(3), 282-290. doi:10.1016/j.copbio.2005.04.007


 * Macheboeuf, P., Di Guilmi, A. M., Job, V., Vernet, T., Dideberg, O., & Dessen, A. (2005).** Active site restructuring regulates ligand recognition in class A penicillin-binding proteins. //Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102//(3), 577-582. doi:10.1073/pnas.0407186102


 * Murray, T., Popham, D. L., & Setlow, P. (1997).** Identification and characterization of pbpA encoding //Bacillus subtilis// penicillin-binding protein 2A. //Journal of Bacteriology, 179//(9), 3021-3029.


 * Sekizaki, T., Tanoue, T., Osaki, M., Shimoji, Y., Tsubaki, S., & Takai, S. (1998).** Improved electroporation of //Rhodococcus equi//. //The Journal of Veterinary Medical Science / the Japanese Society of Veterinary Science, 60//(2), 277-279.


 * Tabor, S., & Richardson, C. C. (1985).** A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes. //Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82//(4), 1074-1078.


 * Wada, A., & Watanabe, H. (1998).** Penicillin-binding protein 1 of //Staphylococcus aureus// is essential for growth. //Journal of Bacteriology, 180//(10), 2759-2765.


 * Zapun, A., Contreras-Martel, C., & Vernet, T. (2008).** Penicillin-binding proteins and beta-lactam resistance. //FEMS Microbiology Reviews, 32//(2), 361-385. doi:10.1111/j.1574-6976.2007.00095.x

= = ANEXOS

= **ANEXO 1** =

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">PknA y PknB solapan mucho, Con el programa informático **Artemis** se ha analizado una parte de genoma, concretamente una secuencia de 17000 nucleótidos. Se obtienen los ORF’s válidos y las proteínas para las cuales codifican después de un análisis de cada ORF en el [|BLAST]. De todas las obtenidas se ha elegido una para el presente trabajo (en rojo). **Penicillin-binding protein PbpA.**

Del National Center for Biotechnology Information ([|NCBI]) se obtiene la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos correspondiente a la proteína elegida.

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">Esas secuencias que ha analizado no son correctas, debía haber usado la que le proporciona Artemis y no la de //R. opacus//. >gi|226362925|ref|YP_002780705.1| penicillin-binding protein PbpA [Rhodococcus opacus B4] MNTPLRRVAIAVMVMVVALLANATYVQVIKADNLRADPRNSRVLLDEYSRQRGQISAAGQVLAASVPTDD RYKYLRTYPPNPAAPSSPLANAPVTGFYSMQYGSTGLERAEDPVLNGSDNRLFGRRFFDLVSGRDPRGGN VVSTINPVMQQVAYDELTAKGYTGSVVAIEPSTGRILTMVSTPSYDPNSLASHDGTETTQAWEALNADPE KPLINRAVSQTYPPGSTFKVVVTAAALAAGTTPDTQLTAAPQITLPGTSTTLENYNGSTCGGAPTASLRE AFARSCNTAFVELGVKTGADAVGDQSSALGIGGQMPGVPFPVADSTIGSIPDDAALGQSSIGQRDVALTP LQNAMIAATVANGGVRMQPQLVSELQGPDLSNLATTNPVSEGQAMSSQVAATLTDLMIGSENNTSGEGKI PGVQIASKTGTAEHGTDPRNTPPHAWYIGFAPAQNPTVAIAVIVEDGGDRALAATGGSVAAPIGRAVIAA GLQGG

La secuencia de nucleótidos que corresponde a PbpA es: ATGAACACACCGCTGCGCCGTGTCGCGATCGCCGTCATGGTGATGGTGGTCGCCCTCCTCGCCAACGCCA CCTACGTTCAGGTCATCAAGGCGGACAACCTGCGGGCCGATCCGCGGAACTCGCGCGTGCTGCTCGACGA GTACTCGCGTCAGCGCGGCCAGATCTCGGCGGCCGGGCAGGTGCTCGCGGCCTCCGTTCCGACCGACGAC CGCTACAAGTACCTGCGGACCTACCCGCCGAACCCGGCGGCGCCGTCGAGCCCGCTGGCCAACGCACCGG TCACCGGTTTCTACTCGATGCAGTACGGCAGCACCGGACTCGAGCGTGCCGAGGACCCGGTCCTCAACGG TTCCGACAACCGGCTGTTCGGGCGTCGCTTCTTCGACCTCGTGTCCGGACGCGACCCGCGTGGCGGCAAT GTGGTGAGCACCATCAACCCGGTGATGCAGCAGGTGGCGTACGACGAGCTGACCGCAAAGGGCTACACCG GTTCGGTCGTGGCGATCGAGCCGAGCACCGGACGCATCCTCACGATGGTGAGCACCCCGAGCTACGATCC CAACTCGCTCGCCAGCCACGACGGCACCGAGACCACCCAGGCGTGGGAGGCGCTGAACGCCGATCCGGAG AAGCCGCTGATCAACCGTGCGGTGTCGCAGACGTACCCGCCCGGTTCCACGTTCAAGGTGGTGGTCACCG CCGCGGCTCTCGCCGCCGGAACCACCCCCGACACCCAGCTGACCGCGGCCCCGCAGATCACTCTTCCCGG CACGTCGACGACGCTCGAGAACTACAACGGCTCCACCTGCGGCGGCGCACCCACCGCGTCGCTGCGGGAA GCGTTCGCGCGGTCCTGCAACACGGCATTCGTCGAACTCGGCGTGAAGACCGGCGCCGACGCCGTCGGCG ACCAGTCCAGCGCACTCGGCATCGGCGGGCAGATGCCCGGCGTCCCGTTCCCCGTCGCCGACAGCACCAT CGGGTCGATCCCCGACGACGCCGCACTCGGCCAGAGCAGCATCGGCCAGCGGGACGTGGCGCTCACCCCG CTGCAGAACGCGATGATCGCGGCTACTGTCGCCAACGGTGGAGTGCGGATGCAGCCACAGCTGGTGTCGG AACTGCAGGGCCCGGACCTGTCGAACCTCGCGACCACCAACCCGGTGTCCGAGGGCCAGGCGATGTCGTC GCAGGTGGCGGCTACCCTGACCGATCTGATGATCGGTTCCGAGAACAACACCAGCGGCGAGGGCAAGATC CCGGGCGTCCAGATCGCGTCCAAGACGGGCACCGCCGAACACGGAACCGACCCACGGAACACCCCGCCCC ACGCCTGGTACATCGGATTCGCACCCGCCCAGAACCCGACCGTCGCCATCGCGGTCATCGTCGAGGACGG CGGAGATCGTGCACTGGCCGCAACCGGCGGCTCGGTGGCTGCACCTATCGGCCGTGCCGTCATCGCAGCC GGACTACAAGGGGGCTGA

= **ANEXO 2** =
 * Peso Molecular**: 51006.1
 * pI Teórico**: 4.92

Porcentaje de la **composición de aminoácidos** presentes en la proteína:

Ala (A) 66 13.3% Arg (R) 24 4.8% Asn (N) 24 4.8% Asp (D) 25 5.1% Cys (C) 2 0.4% Gln (Q) 24 4.8% Glu (E) 17 3.4% Gly (G) 49 9.9% His (H) 3 0.6% Ile (I) 21 4.2% Leu (L) 36 7.3% Lys(K) 8 1.6% Met (M) 11 2.2% Phe (F) 9 1.8% Pro (P) 38 7.7% Ser (S) 38 7.7% Thr (T) 44 8.9% Trp (W) 2 0.4% Tyr (Y) 13 2.6% Val (V) 41 8.3% Pyl (O) 0 0.0% Sec (U) 0 0.0% (B) 0 0.0% (Z) 0 0.0% (X) 0 0.0%

Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 42 Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 32

Carbon C 2215 **Número total de átomos:** 7133 Hydrogen H 3551 Nitrogen N 631 Oxygen O 723 Sulfur S 13
 * Composición Atómica: Fórmula:** C2215H3551N631O723S13

Extinction coefficients are in units of M-1 cm-1, at 280 nm measured in water.
 * Coeficiente de Extinción:**

Ext. coefficient 30495 Abs 0.1% (=1 g/l) 0.598, assuming ALL Cys residues appear as half cystines

Ext. coefficient 30370 Abs 0.1% (=1 g/l) 0.595, assuming NO Cys residues appear as half cystines

La **estimación de vida media** es: 30 hours (mammalian reticulocytes, in vitro). >20 hours (yeast, in vivo). >10 hours (Escherichia coli, in vivo). The **instability index** (II) is computed to be 33.33 This classifies the protein as stable.
 * Aliphatic index:** 82.26
 * Grand average of hydropathicity (GRAVY):** -0.102

= **ANEXO 3** =


 * <span style="font-size: 14pt; color: rgb(153, 51, 102);">PSORTb Resultados **

SeqID: penicillin-binding protein PbpA [Rhodococcus opacus B4] Analysis Report: HMMTOP+ Unknown [1 internal helix found] Motif+ Unknown [No motifs found] Profile+ Unknown [No matches to profiles found] SCL-BLAST+ CytoplasmicMembrane [matched [|20141780] : Cytoplasmic membrane integral membrane protein] SCL-BLASTe+ Unknown [No matches against database] Signal+ Non-Cytoplasmic [Signal peptide detected] Localization Scores: Cytoplasmic 0.00 Cellwall 0.01 Extracellular 0.16 __ CytoplasmicMembrane 9.83 __
 * CytoplasmicMembrane 9.83**
 * Final Prediction:**

penicillin-binding TMHMM2.0 inside 1 6 penicillin-binding TMHMM2.0 TMhelix 7 29 penicillin-binding TMHMM2.0 outside 30 495
 * <span style="font-size: 14pt; color: rgb(153, 51, 102);">TMHMM resultados **
 * 1) penicillin-binding Length: 495
 * 2) penicillin-binding Number of predicted TMHs: 1
 * 3) penicillin-binding Exp number of AAs in TMHs: 22.47035
 * 4) penicillin-binding Exp number, first 60 AAs: 22.40518
 * 5) penicillin-binding Total prob of N-in: 0.99068
 * 6) penicillin-binding POSSIBLE N-term signal sequence



Dominio transmembrana del aminoácido 7 al 29. El resto de la proteína se encuentra en fuera del citoplasma y tan solo del 1 al 6 está dentro.

Using neural networks (NN) and hidden Markov models (HMM) trained on Gram-positive bacteria SignalP-NN result:
 * <span style="font-size: 14pt; color: rgb(153, 51, 102);">SignalP 3.0 Server - prediction results **<span style="font-size: 14pt; color: rgb(153, 51, 102);">
 * penicillin-binding protein PbpA _Rhodococcus opacus B4_**


 * SignalP-HMM result:**

penicillin-binding Prediction: **Signal peptide** Signal peptide probability: **0.997** Max cleavage site probability: 0.753 between pos. 31 and 32

La proteína tiene péptido señal, es una proteína que se excreta al exterior.

= **ANEXO 4** =

El alineamiento se realizó con el programa informático [|Multalin]. Los géneros con los que se comparó nuestra secuencia fueron: //Mycobacterium, Actinomyces, Pseudomonas// y //Escherichia.// Se observaron varias zonas conservadas y se ve claramente la serina del centro activo en la zona conservada situada alrededor de la posición 300.

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">Al no haber usado la secuencia correcta, el arbol no dice mucho.....

El [|análisis filogenético] se realizó con las mismas secuencias de aminoácidos que el alineamiento y se obtuvo el siguiente árbol filogenético:

Siendo //Mycobacterium// y //Actinomyces// los mas próximos a //Rhodococcus//. Es, por otra parte, como cabria esperar ya que los tres géneros son Actinobacterias, Gram + de alto contenido en G+C.