Maria+Ordoñez

María Ordóñez - **Trabajo Final De Ingeniería Genética de Microorganismos**. La organización del tabajo muy bien, pero ha identificado mal la secuencia elegida. No es una amidasa, no empieza donde Ud. dice y es una N-acetilmuramoil-l-Alanina amidasa (LytC). La proteína no empieza po r HLLHHKL....y no tiene nada que ver con acrilamida, sino con degradación de peptidoglucano
 * 

Clonación Heteróloga y Mutagénesis al azar de una nueva Amidasa con potenciales aplicaciones industriales aislada de //Rhodococcus sp//. ** María Ordóñez Robles (1). (1) Departamento de Biología Molecular. Área de Microbiología. Facultad de Biología. Universidad de León. León, 24071. España.

Palabras clave: amidasa, //Rhodococcus//, acrilamida. Las enzimas amidasas se utilizan en la degradación de los residuos de acrilamida y en la producción de ácido acrílico. El gen de la nueva amidasa se descubrió durante la anotación de los ORFs de un fragmento del genoma de una nueva especie de //Rhodococcus//. El gen, que codifica para una proteína de 737 aminoácidos, se expresó heterólogamente en //E. coli// fusionado a colas de histidina para su rápida purificación y análisis posterior y también a GFP para estudiar su localización celular. Finalmente, por mutagénesis al azar sobre el gen de la amidasa, se obtuvo un mutante cuya actividad supera en más de un 50% la de la cepa silvestre.
 * Resumen: **

Las amidasas (EC 3.5.1.4) microbianas son capaces de catalizar la hidrólisis de amidas alifáticas a sus correspondientes ácidos carboxílicos y amonio. Las amidasas bacterianas mejor estudiadas son las de //Brevibacterium// sp. R312, //Rhodococcus rhodochrous// J1 y //Pseudomonas aeruginosa//. Las enzimas nativas constan de un bajo número de subunidades idénticas y exhiben dos tipos de actividad- amidohidrolasa (1) y aminotransferasa (2)- ( Kotlova,E.K. 1999): R-CONH2 + H2O → R-COOH + NH3 (1)
 * Introducción: **

R-CONH2 + NH2OH → R-CONHOH + NH3 (2) Estas enzimas están involucradas en el metabolismo del nitrógeno en las células y están ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se encuentran habitualmente en actinomicetos (//Nocardia, Rhodococcus, Arthrobacter//). En concreto, el género //Rhodococcus// cataliza una amplia variedad de biotransformaciones y se aplica en la biorremediación gracias a su capacidad de vivir en medios pobres en nutrientes (Warhurst & Fewson, 1994).  Esta referencia no aparece en la bibliografía. Las amidasas aisladas de diferentes organismos se caracterizan por tener diferentes especificidades de sustrato (algunas catalizan la hidrólisis de amidas de ácidos alifáticos, amidas de ácidos aromáticos, amidas de α- o ω- aminoácidos e incluso existen amidasas estereoselectivas de las cuales algunas se emplean en la producción de D- y L- α-aminoácidos). Las amidasas se utilizan en la producción de antibióticos (penicilina acilasa), la hidrólisis de los grupos amida Ct de los péptidos, transformación de imidas cíclicas, etc( Trott,S. 2001). Este tipo de enzimas se utilizan en la degradación de acrilamida y pueden ser también útiles como catalizadores en la producción a gran escala de ácido acrílico, compuesto de importante aplicación industrial. Se considera que la producción mundial de acrilamida supera las 200.000 toneladas (Nagasawa,T. 1989). La acrilamida se utiliza en numerosos procesos industriales y su liberación indiscriminada en el medio ha dado lugar a la contaminación de ecosistemas acuáticos y terrestres (Cherry, A. B . 1956, Croll, B. T. 1974, Nishikawa, H. 1978). En este artículo presentamos un análisis sobre la nueva amidasa encontrada en //Rhodococcus// sp, así como la generación de una nueva variante de la misma por mutagénesis //in Vitro// con potenciales aplicaciones en la degradación a gran escala de residuos de acrilamida. __ Tratamiento informático de las secuencias: __ La anotación de los ORFs se realizó mediante el programa Artemis. Los alineamientos y el árbol filogenético de secuencias homólogas obtenidas con el programa Blast-p del NCBI ([]) se realizó mediante los programas MultAlin y MEGA 4.1.El árbol filogenético se realizó mediante el método Neighbour-Joining (Saitou, N.1987). Las predicciones acerca de los motivos estructurales de la proteína se realizaron mediante los programas online: TMPred (Expasy), MotifScan, Pfam (Sanger Institute), ProtParamTool (Expasy), Psortb, Signal 3.0 Server (CBS), TatP 1.0 Server (CBS), ProtScale (Expasy), COILS (EMBnet), TMHMM Server (CBS), etc. En todo caso se utilizaron los parámetros determinados por defecto, salvo en aquellos casos en los que se pidió determinar a que tipo de microorganismo pertenece la secuencia (Gram+). __ Obtención de la proteína fusionada a colas de histidina en el extremo Nt __ : Los primers utilizados para la amplificación del gen de la amidasa son los siguientes: el primer directo (5’-//GGAATTC//__CATATG__CATCTGCATCACAAGTTGCA -3’) presenta 6 nucleótidos adicionales para crear un sitio de restricción NdeI (subrayado) y nucleótidos adicionales (en cursiva) para aumentar la eficacia del enzima de restricción; el primer reverso (5’- //C//__CTTAAG__TCAGTTGATCGCGACCG-3’) presenta 7 nucleótidos adicionales en total para crear un sitio de restricción EcoRI efectivo. El fragmento de 2214 pb amplificado se clonó en los sitios correspondientes del plásmido pET28a (Novagen) para generar la proteína con colas de histidina en //E.coli// BL21(DE3). Se comprobaron los insertos mediante secuenciación por PCR utilizando los primers específicos del vector (promotor y terminador de T7). La construcción obtenida se denominó pAMH1.La purificación de la proteína se realizó con el kit His60 Ni Superflow Resin (Clontech). Las proteínas se liberaron del tag mediante digestión con trombina. Previamente comprobamos mediante análisis informático la no existencia de puntos de corte para la trombina en nuestra proteína. __ Interrupción del gen: __ La obtención de cepas de //Rhodococcus// deficientes en amidasa se realizó mediante recombinación homóloga con un fragmento interno del gen de la amidasa. Para ello se amplificó un segmento interno de 200bp que se clonó posteriormente en el plásmido pBR322 (Fermentas). El primer directo (5’-//GC//__GTCGAC__AACTACACGCGTGAGCAGTCC -3’) lleva nucleótidos adicionales para crear un sitio de corte SalI, el primer reverso (5’-//GC//__CGATC__GCGATACCGACGGTGTTCT -3’) lleva nucleótidos adicionales para crear un sitio de restricción NheI. La clonación del fragmento se realizó en orientación contraria en el gen tetr para evitar la formación de proteínas fusión. Con la construcción resultante (pAIF2) se transformó //Rhodococcus// por electroporación (GenePulser MXcell, Biorad). La interrupción se confirmó por PCR. __ Análisis de la localización celular mediante fusión a GFP: __ El análisis de la localización celular de la amidasa en //Rhodococcus// se realizó mediante la fusión de la GFP de //Aequorea victoria// (X83959.1) al extremo Nt de la amidasa. Para ello se diseñaron los siguientes primers: primer 1 (5´-//CCC//__AAGCTT__GGATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA-3´, punto de corte para HindIII); primer 2 (5´-TGCAACTTGTGATGCAGATG**GTATAGTTCATCCATGCCA**-3´); primer 3 (5´-**TGGCATGGATGAACTATAC**CATCTGCATCACAAGTTGCA-3´) y primer 4 (5´-//GC//__GTCGAC__TCAGTTGATCGCGACCG-3´, punto de corte para SalI).Posteriormente se clonó la secuencia fusión en el vector pUC18a. //Rhodococcus// se transformó por electroporación. El equipo de trabajo dispuso de un vector creado anteriormente en el propio laboratorio que contiene el cDNA de la GFP para su amplificación (pGFUL). La absorción de fluorescencia se valoró a 395 nm y la emisión a 509 nm mediante microscopio de fluorescencia Nikon E400.Las fotografías fueron tomadas con una cámara digital Nikon DN100 y se trataron posteriormente con Corel Draw. __ Mutagénesis al azar por PCR: __ La generación de una amidasa mutante por PCR se realizó utilizando la cepa mutadora de //E.coli// XL1-Red (deficiente en tres de los sistemas de reparación principales) – Stratagene-(adaptado de Kwon, 2008). El gen se clonó en el plásmido pUC18 (Fermentas), utilizándose dos primers (directo 5’- // GC //__ TCTAGA __ GGCATCTGCATCACAAGTTGCA-3’ y reverso 5’-  // CC //__ CCATG __ GGGTTGATCGCGACCG) modificados para crear los sitios de restricción XbaI y KpnI respectivamente respetando el marco de lectura. Con la construcción (pARMM) se transformó //E.coli// XL1-Red y las células resultantes se cultivaron en medio LB suplementado con ampicilina en las concentraciones aconsejadas por el manual durante 24h a 37ºC. Los vectores portadores del gen mutado se introdujeron en //E.coli// XL1-Blue como indica el manual para valorar las mutaciones por PCR. Los plásmidos con las diferentes mutaciones se digirieron con XbaI y KpnI y los genes mutados se clonaron en el plásmido pBS305 (cortesía del //Centre for Land and Biological Resources Research, Ottawa, Canadá//) previamente digerido con las mismas enzimas. Con las construcciones resultantes se transformó la cepa de //Rhodococcus// que tenía el gen interrumpido y se valoró el efecto de las mismas en medio con acrilamida. __ Cepas, vectores y medios empleados (Tabla 1) __ : Para la obtención de DNA genómico, //Rhodococcus// se cultivó en medio LB con glicina y sacarosa, ambas al 1,6% peso/vol. (adaptado deTrott,S. 2002). Las cepas de E.coli fueron cultivadas en medio LB suplementado con ampicilina o kanamicina ( 100μg/ml) -cuando fuera necesario para la selección de plásmidos-y crecidas a una temperatura de 37ºC, en agitación. Para conseguir expresar la amidasa en el vector pET28a se suplementó el medio con IPTG 0.8 mM cuando D.O.=0.5. __ Preparación de extractos celulares para aislar DNA __ : Volúmenes de 1,5 ml de cultivos celulares de //Rhodococcus// crecido en medio LB se centrifugaron a 15000 rpm durante 7 minutos. El pellet de células fue resuspendido en 1 ml de una solución de sacarosa al 10% conteniendo 10 mg de lisozima y se incubó durante 2h a 37ºC. La preparación del DNA genómico se realizó siguiendo el método de Ausubel (Ausubel, F. M. 1987) -(adaptado deTrott, S. 2002)-. Las células de //E. coli// se homogeneizaron mediante prensa de French. Las células no disgregadas y otros residuos se eliminaron por centrifugación a 95000xg durante 20 minutos a 4ºC. El DNA plasmídico de //E. coli// se aisló mediante el kit comercial Flexi-Prep (Amersham Pharmacia Biotech) -(adaptado deTrott,S. 2002)-. Las concentraciones proteicas se determinaron por el método Bradford utilizando como control albúmina sérica bovina (Bradford,M.M. 1976). __ Manipulación de DNA __ : La digestión de DNA, electroforesis y ligación con la DNA ligasa de T4 (Gibco BRL) se realizó de acuerdo a los procedimientos habituales (Sambrook, J. 1989) La GoTaq polimerasa y las enzimas de restricción utilizadas proceden de Promega. __ Clonación del gen por PCR __ : Para la clonación del gen en el vector pET28a y para su fusión a GFP, las mezclas de reacción para PCR se realizaron a un volumen final de 50 μl, 50 pmol de cada primer, 0,1 μg de DNA molde, 100 μM de desoxinucleótidos trifosfato, 1.5 mM MgCl2, 0,3 U de la polimerasa y el tampón de reacción correspondiente. La desnaturalización se llevó a cabo durante 15 minutos a 95ºC seguido de 30 ciclos a 94ºC (1 minuto), 60ºC (30 s) y 72ºC (4 minutos). La extensión final se realizó a 72ºC durante 10 minutos. En el caso de la amplificación del gen para su inserción en el plásmido pUC18, las condiciones fueron las mismas excepto que se emplearon 0,5 U de polimerasa. La amplificación de la secuencia de GFP se realizó en condiciones idénticas excepto que la temperatura de anillamiento fue de 55ºC y el número de ciclos 27. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador GeneAmp® 9700 (Applied Biosystems, USA). En el caso de la amplificación de un fragmento interno del gen, la temperatura de anillamiento de los primers fue de 56ºC y el número de ciclos fue 24. En todos los casos en los que se realizó Southern blot para comprobar el inserto, se utilizó como sonda el fragmento interno amplificado de 200 bp marcado con biotina. La hibridación se realizó a 65ºC (SensiblotTM Plus Nylon Membrane y Biotin DecaLabelTM DNA Labeling Kit de Fermentas). __ Transformación de los microorganismos __ : La transformación de //Rhodococcus// sp. se realizó por electroporación utilizando GenePulser MXcell (Biorad). La transformación de //E.coli// crecida en medio LB se realizó mediante el método descrito por Inoue (Inoue, H. 1990). __ Secuenciación del extremo Nt: __ Se realizó mediante degradación Edman automatizada, con un secuenciador 470A PTH (Applied Biosystems) y un analizador de aminoácidos 120A PTH. __ Valoración de la actividad amidasa __ : Se ensayó a 37ºC mediante la liberación de amonio procedente de la acrilamida. La mezcla de ensayo consistió en 990 μl de tampón fosfato potásico 100 mM pH 7.2 y 28.5 mM de acrilamida y 10 μl de la solución de enzima. Las mezclas se incubaron durante 30 minutos y el amonio liberado se valoró colorimétricamente (Kaplan, A. 1969). La enzima desnaturalizada por hervido se utilizó como control. La valoración de ácido acrílico y amida se valoró por HPLC (HPLC Millenium Chromatography Manager 2.0.)-adaptado de (Hirrlinger, 1997)-. Las placas de agar utilizadas para valorar la actividad amidasa de los mutantes contenían un 13% de acrilamida. __ Determinación del peso molecular: __ El peso molecular de la enzima nativa se determinó por gel-filtración en una columna (1 x 30 cm) de Superosa 12 equilibrada con tampón fosfato potásico (10 mM, pH 7,3). El flujo de la columna fue de 0.5 ml/min. Se utilizaron como marcadores de peso molecular: aldolasa (150 kDa), catalasa (232 kDa), ferritina (444 kDa) y tiroglobulina (669 kDa) –adaptado de Nawaz, 1994)-. La determinación del peso molecular de las subunidades de la proteína se determinó por SDS (0,1%)-PAGE, utilizando un gel al 12,5% de poliacrilamida y mediante el método descrito por Laemmli en 1970. La electroforesis se desarrolló a 50 mA y 150 V.La muestra (20-30 μl, 1mg/ml) se obtuvo mediante la disolución de la proteína en urea 8 M conteniendo tampón fosfato sódico 10 mM pH 7.4, 1% SDS y 1% de mercaptoetanol. La tinción se realizó con Coomasie Blue R-250, el exceso de colorante se eliminó con ácido acético al 7% a 100ºC. Adaptado de (Kotlova,E.K. 1999). __ Número de acceso a las secuencias nucleotídicas: __ Los datos de secuencias citadas en este artículo aparecerán en la base de datos GenBank bajo el número de acceso MR025487.
 * Fig.1.Representación de la reacción catalizada por las amidasas en la base de datos Brenda **
 * Materiales y métodos: **
 * Tabla 1. Cepas y vectores utilizados en este trabajo **.

El análisis de la secuencia de //Rhodococcus sp//. mediante el programa Artemis permitió identificar 8 ORFs (Fig.2). La comparación de la secuencia aminoacídica de cada uno de ellos con la base de datos del NCBI (blastp) permitió encontrar un ORF (designado como //amdR//) que codificaba una hipotética enzima de actividad amidasa. **Fig. 2. A) Resultado de la búsqueda de ORFs con el programa Artemis.** Se muestra recuadrado el ORF elegido (hipotética enzima de actividad amidasa). ** B) Secuencia nucleotídica del ORF elegido. **
 * Cepas y vectores || Características ||
 * // Rhodococcus // sp. || Nueva cepa de estudio ||
 * // E.coli // BL(DE3) || F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm ||
 * // E.coli // XL21-Red || endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac mutD5 mutS mutT Tn10 (Tetr)a ||
 * // E.coli // XL21-Blue || recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] ||
 * pBR322 || Vector de clonación; ori pMB1 Ampr,15-20 copias. ||
 * pUC18 || Vector de clonación;ori pMB1, Ampr,500-700 copias. ||
 * pET28a || Vector de superexpresión; expresión inducible por IPTG, Kmr ||
 * pBS305 || Vector E.coli-Rhodococcus, Ampr,Thior ||
 * pGFUL || Vector de amplificación de GFP (//Aequorea victoria//) ||
 * Resultados y Discusión: **

Los resultados obtenidos al introducir la secuencia de la nueva amidasa en la base de datos del NCBI indican que presenta un 53% de homología con una proteína de //Rhodococcus erythropolis// SK121 que presenta dominios repetidos LGFP. En la figura 3 se muestran los resultados del alineamiento con el programa MultAlin de la amidasa con las 5 secuencias que presentaron mayor homología en dicho análisis.


 * Fig.3.Resultado del alineamiento mediante el programa MultAlin de la hipotética amidasa con las 5 secuencias de mayor homología. ** Leyenda: R.SK121 (proteína con dominios LGFP repetidos de //R.erythropolis// SK121 -53% de homología-), RER_02040 (proteína hipotética RER_02040 de //R.erythropolis//), ROP 39280 (proteína hipotética ROP 39280 de //R. opacus// B4), RHA1 ro04050 (proteína hipotética RHA1 ro04050 de //R.jostii// RHA1), nfa1710 (proteína hipotética nfa 1710 de //Nocardia farcinica// IFM 10152)

El alineamiento realizado con la secuencia aminoacídica de la nueva amidasa y con otras proteínas homólogas de otros microorganismos emparentados mediante el programa MEGA permitió determinar los residuos aminoacídicos conservados en todas estas secuencias (Fig.4). El dendrograma, realizado con el programa MEGA, se presenta en la figura 5.


 * Fig.4. Secuencia aminoacídica de la proteína con actividad amidasa en la que se presentan subrayados los residuos conservados en todas las secuencias analizadas **** . **


 * Fig.5.Dendrograma realizado mediante el método Neighbour-Joining de las secuencias relacionadas con la proteína hipotética de actividad amidasa ** . El árbol se ha dibujado a escala, utilizando las mismas unidades para la longitud de las ramas y el cálculo de las distancias evolutivas. Las distancias evolutivas se han calculado mediante el método de corrección de Poisson y se expresan en función del número de sustituciones aminoacídicas por sitio. Todas las posiciones con gaps o sin datos se eliminaron del conjunto de datos (opción Complete deletion). En el conjunto final de datos existía un total de 191 posiciones.

Para comprobar que la secuencia predicha en el extremo Nt coincide con la real se realizó secuenciación de dicho extremo mediante el método de Edman.Los resultados se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Secuencia del extremo Nt ** El análisis bioinformático de la secuencia de 737 aminoácidos mediante los programas Pfam del Sanger Institute y MotifScan indicó que el dominio amidasa se halla entre los residuos 374 y 550 y que existe un dominio rico en Alanina (13.6% del total de aminoácidos) (Fig 6).
 * Extremo Nt || Secuencia aminoacídica || Secuencia de bases ||
 * || HLHHKLQTSSDELWTSS || CATCTGCATCACAAGTTGCAGACATCCTCGGATGAACTGTGGACTTCCTCC  ||

** Fig. 6. Resultados del análisis de dominios mediante el programa MotifScan. ** La predicción informática de la localización de la proteína con el programa Psortb fue inconcluyente. Los resultados del análisis con los programas SignalP 3.0 Server y TatP 1.0 Server del CBS indicaron que no existen péptidos señal ni péptidos señal //tat// respectivamente en la secuencia de la proteína (Fig.7 y 8). Tampoco se determinaron dominios coiled-coil en la proteína con el programa COILS del EMBnet (datos no mostrados).

** Fig.7. Predicción de péptidos señal mediante el programa SignalP 3.0 (CBS) ** Los resultados obtenidos con el programa TMPred (Expasy) permitieron concluir que presenta dos hélices transmembrana (de las posiciones 81 a 97 y de 654 a 676) estando tanto el extremo amino terminal (His) como el Ct (N) en el interior celular (Fig.9). Los resultados obtenidos con el programa TMHMM corroboran la existencia de un dominio transmembrana en las posiciones 81 a 97(Fig.10).
 * Fig.8. Predicción de péptidos señal Tat mediante el programa TatP1.0 (CBS) **

**Fig.9. Predicción de la localización mediante el programa TMPred (Expasy).** El análisis informático de la secuencia mediante ProtParam Tools de Expasy determinó que el peso molecular de la enzima es de 76059.9 Da y que tiene un pI teórico de 4.75. La composición aminoacídica predicha se muestra en la tabla 3. El índice de inestabilidad de la proteína calculado por el programa fue 39.81, por lo que la proteína es considerada estable.
 * Fig.10. Resultado del análisis de la secuencia de 737 aminoácidos con el programa TMHMM 2.0 del CBS. **

La búsqueda de promotores y terminadores mediante análisis bioinformático resultó infructuosa, por lo que proponemos la realización de análisis //in Vitro// o //in vivo// para hallar el inicio de la transcripción en sucesivas investigaciones. La proteína purificada dio lugar a una banda de 77 ± 2 kDa en SDS-PAGE (datos no mostrados), valor muy cercano al predicho mediante métodos informáticos. La proteína purificada tuvo un peso molecular de 310 ± 10 kDa (datos no mostrados). En base a estos resultados, sugerimos que la nueva amidasa consiste en un tetrámero de cuatro subunidades idénticas en peso molecular. El tamaño y número de subunidades de las amidasas hasta ahora estudiadas varía ampliamente (Kotlova,E.K. 1999). La expresión de la proteína fusionada a GFP permitió comprobar que la localización anteriormente aceptada de la misma en la membrana celular es real (Fig. 11).
 * Tabla 3. Composición aminoacídica predicha para la amidasa según el programa ProtParam de la base de datos Expasy **.
 * Aminoácido || Nº de resíduos || % ||
 * Ala (A) || 100 || 13.6 ||
 * Arg || 30 || 4.1 ||
 * Asn (N) || 36 || 4.9 ||
 * Asp (D) || 40 || 5.4 ||
 * Cys (C) || 3 || 0.4 ||
 * Gln (Q) || 29 || 3.9 ||
 * Glu (E) || 33 || 4.5 ||
 * Gly (G) || 78 || 10.6 ||
 * His (H) || 11 || 1.5 ||
 * Ile (I) || 38 || 5.2 ||
 * Leu (L) || 52 || 7.1 ||
 * Lys (K) || 15 || 2.0 ||
 * Met (M) || 12 || 1.6 ||
 * Phe (F) || 16 || 2.2 ||
 * Pro (P) || 63 || 8.5 ||
 * Ser (S) || 48 || 6.5 ||
 * Thr (T) || 59 || 8.0 ||
 * Trp (W) || 8 || 1.1 ||
 * Tyr (Y) || 15 || 2.0 ||
 * Val (V) || 51 || 6.9 ||
 * Pyl (O) || 0 || 0.0 ||
 * Sec (U) || 0 || 0.0 ||

**Fig.11. Localización de la GFP fusionada a la amidasa de //Rhodococcus sp// en la membrana celular.**

El análisis del catabolismo de la acrilamida a ácido acrílico y amonio durante el cultivo se representa en la figura 12. Las máximas concentraciones de ácido acrílico (42.6 mM) y amonio (31.2 mM) se detectaron a las 24 horas. El punto máximo de crecimiento se encontró entre las 72 y las 96 horas de cultivo a 28ºC. La nueva amidasa estudiada en este trabajo se expresa constitutivamente en //Rhodococcus//, no siendo así en el caso de otros microorganismos productores de amidasas utilizados industrialmente. ** Fig.12. Crecimiento de //Rhodococcus// sp. en acrilamida y formación de ** ** metabolitos ****. ** Símbolos : ● ácido acrílico, ○  crecimiento , ■  amonio , □  acrilamida. Los mutantes con el gen de la amidasa interrumpido no manifestaron modificaciones fenotípicas observables. La generación de mutantes mediante la cepa mutadora de //E.coli// XL21-Red, permitió obtener 17 mutantes (listados en la tabla 4). La mayoría de las mutaciones resultaron en una pérdida completa de la actividad amidasa. Los mutantes AMR10 y 11 mantuvieron prácticamente la misma actividad amidasa, mientras que AMR7 incrementó dicha actividad en un 57% respecto a la cepa silvestre (Fig.13).
 * Tabla 4. ** **Mutantes obtenidos por mutagénesis al azar y resultado del análisis de las mutaciones por PCR.**


 * **Mutante** || **Mutación** ||
 * AMR1 || G369D ||
 * AMR2 || D423E ||
 * AMR3 || R365G ||
 * AMR4 || W488G ||
 * AMR5 || H415Q ||
 * AMR6 || W421C ||
 * AMR7 || C422W ||
 * AMR8 || Y414C ||
 * AMR9 || Y426stop ||
 * AMR10 || Q377H ||
 * AMR11 || P21L ||
 * AMR12 || F433L ||
 * AMR13 || T559I ||
 * AMR14 || R528H ||
 * AMR15 || M698I ||
 * AMR16 || P355L ||
 * AMR17 || A673V ||

La mayor parte de las mutaciones de pérdida de actividad amidasa se produjeron dentro de la región ampliamente conservada. Estos resultados pueden servir de base para posteriores investigaciones acerca de la importancia de ciertos residuos aminoacídicos en la catálisis y su localización en el centro activo.


 * Fig.13. Colonias mutantes sobre placa de agar con poliacrilamida ** .La suave coloración rojiza de las colonias tras 76 horas de cultivo no es apreciable en esta imagen en blanco y negro.

La generación de una amidasa (AMR7) mutante que supera en mas de un 50% la actividad hidrolítica de la enzima silvestre puede tener implicaciones considerables en la degradación a nivel industrial y ecológico de los residuos de acrilamida y en la producción industrial de ácido acrílico. Nuestra investigación sirve de sustento para el estudio en profundidad de la nueva amidasa. Se ha obtenido suficiente cantidad de enzima pura para su cristalización y análisis estructural. El objetivo de próximos trabajos será profundizar en las características tanto de la amidasa silvestre como de la amidasa mutante, principalmente en sus aspectos cinéticos, especificidad de sustrato, estabilidad a diferentes pHs y temperaturas e influencia de metales o inhibidores sobre su actividad. Agradecimientos: ** Damos las gracias a C. Peterson del Erlenmayer Institute de Londres por prestar al grupo de trabajo la nueva cepa de //Rhodococcus// aislada así como la secuencia del genoma completa para su anotación. Así mismo agradecemos al //Centre for Land and Biological Resources Research, Ottawa,Canadá,// la cesión del vector pBS305. Todo el trabajo ha sido financiado por la Junta de Castilla y León, dentro del programa BRI (Biodegradación de Residuos Industriales).

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__Pies de figuras y tablas__ ** __:__
 * Fig.1.Representación de la reacción catalizada por las amidasas en la base de datos Brenda. **
 * Tabla 1. Cepas y vectores utilizados en este trabajo. **
 * Fig. 2. A) Resultado de la búsqueda de ORFs con el programa Artemis. ** Se muestra recuadrado el ORF elegido (hipotética enzima de actividad amidasa).
 * B) Secuencia nucleotídica del ORF elegido. **
 * Fig.3.Resultado del alineamiento mediante el programa MultAlin de la hipotética amidasa con las 5 secuencias de mayor homología. ** Leyenda: R.SK121 (proteína con dominios LGFP repetidos de //R.erythropolis// SK121 -53% de homología-), RER_02040 (proteína hipotética RER_02040 de //R.erythropolis//), ROP 39280 (proteína hipotética ROP 39280 de //R. opacus// B4), RHA1 ro04050 (proteína hipotética RHA1 ro04050 de //R.jostii// RHA1), nfa1710 (proteína hipotética nfa 1710 de //Nocardia farcinica// IFM 10152)
 * Fig.4. Secuencia aminoacídica de la proteína con actividad amidasa en la que se presentan subrayados los residuos conservados en todas las secuencias analizadas **** . **
 * Fig.5.Dendrograma realizado mediante el método Neighbour-Joining de las secuencias relacionadas con la proteína hipotética de actividad amidasa ** . El árbol se ha dibujado a escala, utilizando las mismas unidades para la longitud de las ramas y el cálculo de las distancias evolutivas. Las distancias evolutivas se han calculado mediante el método de corrección de Poisson y se expresan en función del número de sustituciones aminoacídicas por sitio. Todas las posiciones con gaps o sin datos se eliminaron del conjunto de datos (opción Complete deletion). En el conjunto final de datos existía un total de 191 posiciones.
 * Tabla 2. Secuencia del extremo Nt. **
 * Fig. 6. Resultados del análisis de dominios mediante el programa MotifScan. **
 * Fig.7. Predicción de péptidos señal mediante el programa SignalP 3.0 (CBS). **
 * Fig.8. Predicción de péptidos señal Tat mediante el programa TatP1.0 (CBS). **
 * Fig.9. Predicción de la localización mediante el programa TMPred (Expasy). **
 * Fig.10. Resultado del análisis de la secuencia de 737 aminoácidos con el programa TMHMM 2.0 del CBS. **
 * Tabla 3. Composición aminoacídica predicha para la amidasa según el programa ProtParam de la base de datos Expasy. **
 * Fig.11. Localización de la GFP fusionada a la amidasa de //Rhodococcus sp// en la membrana celular. **
 * Fig.12. Crecimiento de //Rhodococcus// sp. en acrilamida y formación de ** ** metabolitos **** . ** Símbolos : ● ácido acrílico, ○  crecimiento , ■  amonio , □  acrilamida.
 * Tabla 4. ** ** Mutantes obtenidos por mutagénesis al azar y resultado del análisis de las mutaciones por PCR. **
 * Fig.13. Colonias mutantes sobre placa de agar con poliacrilamida. ** La suave coloración rojiza de las colonias tras 76 horas de cultivo no es apreciable en esta imagen en blanco y negro.