David+Labrousse

.Situación taxonómica
Como se puede observar en este arbol filogenetico anuestra enigmática especie que aparece como Query es de la especie Rhodococcus con un 81% de posibilidades de ser Rhodococcus opacus

__Taxonomía del microorganismo__:
Reino: Bacteria Phylum: __Actinobacteria__ Clase: __Actinobacteria__ Subclase: __Actinobacteridae__ Orden: __Actinomycetales__ Suborden: __Corynebacterineae__ Familia: __Nocardiaceae__ Géneros: //Rhodococcus//

2. Análisis informático de la secuencia mediante el programa ARTEMIS
Con la secuencia de 17000 bases que se nos ha dado estudiamos todos los ORFs a través de la aplicación blast del NCBI. El fragmento contiene 86 ORFs (CDS). Se indican a continuación los que codifican para proteínas y el lugar que ocupan en mi segmento de DNA:

Falta el esquema de Artemis

552:2330 reverse 815 bp at 5' side: MarR-family protein transcriptional regulator 290 bp at 3' side: elongation factor Ts

1984:2790 forward transcriptional regulator, TetR family protein

2806:4530 reverse extradiol dioxygenase

6014:6721 forward superoxide dismutase Score = 86.1 bits (46), Expect = 4e-13 Identities = 392/551 (71%), Gaps = 55/551 (9%) Strand=Plus/Plus

6538:7728 reverse ribonucleotide-diphosphate reductase subunit beta Score = 551 bits (298), Expect = 6e-153 Identities = 776/995 (77%), Gaps = 80/995 (8%) Strand=Plus/Minus

7562:9013 forward hypothetical membrane protein 8186:9163 reverse hypothetical membrane protein 10623:12377 forward hypothetical protein hypothetical membrane protein

10900:11721 reverse hypothetical protein 11399:11980 forward hypothetical protein 12352:13320 forward hypothetical protein

13148:14917 reverse superoxide dismutase

14792:15172 forward 88 bp at 5' side: superoxide dismutase 123 bp at 3' side: putative acyltransferase

15048:16979 reverse putative acyltransferase peptide methionine sulfoxide reductase MsrA

16328:17000 forward peptide methionine sulfoxide reductase MsrA

Nombres de los genes en castellano, si escribe en castellano

Secuencia elegida:
6538:7728 reverse ribonucleotide-diphosphate reductase subunit beta Score = 551 bits (298), Expect = 6e-153 Identities = 776/995 (77%), Gaps = 80/995 (8%) Strand=Plus/Minus

AGGCCGACTACATCGATCGGCTGTGGTCGCTCGTCGACTGGTCGGATGTGGGACGCAGGT TCGAGGCGGCGCGCGCCGGACGCGCGTTCGACCTACGGGAGGCGATCGGCGGTGAGTGAC CGCCTGGTCGATCGGGTTCACGCGATCAACTGGAACCGGGTGCCGGACCCCAAGGACGCC GAGGTGTGGGACCGACTCACCGGCAATTTCTGGCTGCCCGAGAAGATTCCGCTGTCCAAC GACCTCGCCTCGTGGGCGACGCTGACCGACACCGAGCGAGAGATGACCATCCGGGTGTTC ACCGGGTTGACGTTGCTCGACACCGCGCAGGCCACCGTCGGAGCCGTCGCGATGATCGCC GATGCCGTCACCCCACACGAGGAGGCCGTCCTGACGAACATGGCCTTCATGGAGTCGGTG CACGCCAAGAGCTACAGTTCGATCTTCTCGACGCTGTGCTCCACTCGGCAAATCGATGCG GCGTTCGAGTGGTCGGAGCGCAACCCGCACCTGCAGCGCAAGGCGCAGATCGTCGTCGAC TACTACCGCGGCGACGACGCCCTCGCCCGCAAGGCGGCGTCGGTGATGCTCGAATCGTTC CTGTTCTACAGCGGCTTCTACCTGCCGATGTACTGGGCAAGCCACGGCGAACTCACCAAC ACCGCCGACCTGATCCGGTTGATCATCCGCGACGAGGCGGTACACGGGTACTACATCGGA TACAAGTGCCGCAAAGCGCTCGAACGGCTCGACGCGAGCGCGCGCGACGCGCATCGGCGC TACACCTACGACTTGTTGGAGACGCTCTATGCCAACGAGGTCGCGTACGCCGCCGATCTG TACGACGAGGTGGGGTGGACGGCAGAGGTGGTGTCCTACATGCGGTTCAACGCGAACAAG GCGCTCGCCAATCTCGGATACGAGCCCATGTTCCCAGTGTCCGAGTGCCAGGTGAACCCG GCGATCCTGTCGGCCCTCGATCCCGGGGCCGGAGAGAACCACGACTTCTTCTCCGGCTCC GGCAGCGCATACGTCATCGGGAAGCAGAAACCCACCGAGGACGTGGACTGGAACTTCTGA

En Doble cadena: AGGCCGACTACATCGATCGGCTGTGGTCGCTCGTCGACTGGTCGGATGTGGGACGCAGGTTCGAGGCGGC 0 TCCGGCTGATGTAGCTAGCCGACACCAGCGAGCAGCTGACCAGCCTACACCCTGCGTCCAAGCTCCGCCG 0

GCGCGCCGGACGCGCGTTCGACCTACGGGAGGCGATCGGCGGTGAGTGACCGCCTGGTCGATCGGGTTCA 70 CGCGCGGCCTGCGCGCAAGCTGGATGCCCTCCGCTAGCCGCCACTCACTGGCGGACCAGCTAGCCCAAGT 70

CGCGATCAACTGGAACCGGGTGCCGGACCCCAAGGACGCCGAGGTGTGGGACCGACTCACCGGCAATTTC 140 GCGCTAGTTGACCTTGGCCCACGGCCTGGGGTTCCTGCGGCTCCACACCCTGGCTGAGTGGCCGTTAAAG 140

TGGCTGCCCGAGAAGATTCCGCTGTCCAACGACCTCGCCTCGTGGGCGACGCTGACCGACACCGAGCGAG 210 ACCGACGGGCTCTTCTAAGGCGACAGGTTGCTGGAGCGGAGCACCCGCTGCGACTGGCTGTGGCTCGCTC 210

AGATGACCATCCGGGTGTTCACCGGGTTGACGTTGCTCGACACCGCGCAGGCCACCGTCGGAGCCGTCGC 280 TCTACTGGTAGGCCCACAAGTGGCCCAACTGCAACGAGCTGTGGCGCGTCCGGTGGCAGCCTCGGCAGCG 280

GATGATCGCCGATGCCGTCACCCCACACGAGGAGGCCGTCCTGACGAACATGGCCTTCATGGAGTCGGTG 350 CTACTAGCGGCTACGGCAGTGGGGTGTGCTCCTCCGGCAGGACTGCTTGTACCGGAAGTACCTCAGCCAC 350

CACGCCAAGAGCTACAGTTCGATCTTCTCGACGCTGTGCTCCACTCGGCAAATCGATGCGGCGTTCGAGT 420 GTGCGGTTCTCGATGTCAAGCTAGAAGAGCTGCGACACGAGGTGAGCCGTTTAGCTACGCCGCAAGCTCA 420

GGTCGGAGCGCAACCCGCACCTGCAGCGCAAGGCGCAGATCGTCGTCGACTACTACCGCGGCGACGACGC 490 CCAGCCTCGCGTTGGGCGTGGACGTCGCGTTCCGCGTCTAGCAGCAGCTGATGATGGCGCCGCTGCTGCG 490

CCTCGCCCGCAAGGCGGCGTCGGTGATGCTCGAATCGTTCCTGTTCTACAGCGGCTTCTACCTGCCGATG 560 GGAGCGGGCGTTCCGCCGCAGCCACTACGAGCTTAGCAAGGACAAGATGTCGCCGAAGATGGACGGCTAC 560

TACTGGGCAAGCCACGGCGAACTCACCAACACCGCCGACCTGATCCGGTTGATCATCCGCGACGAGGCGG 630 ATGACCCGTTCGGTGCCGCTTGAGTGGTTGTGGCGGCTGGACTAGGCCAACTAGTAGGCGCTGCTCCGCC 630

TACACGGGTACTACATCGGATACAAGTGCCGCAAAGCGCTCGAACGGCTCGACGCGAGCGCGCGCGACGC 700 ATGTGCCCATGATGTAGCCTATGTTCACGGCGTTTCGCGAGCTTGCCGAGCTGCGCTCGCGCGCGCTGCG 700

GCATCGGCGCTACACCTACGACTTGTTGGAGACGCTCTATGCCAACGAGGTCGCGTACGCCGCCGATCTG 770 CGTAGCCGCGATGTGGATGCTGAACAACCTCTGCGAGATACGGTTGCTCCAGCGCATGCGGCGGCTAGAC 770

TACGACGAGGTGGGGTGGACGGCAGAGGTGGTGTCCTACATGCGGTTCAACGCGAACAAGGCGCTCGCCA 840 ATGCTGCTCCACCCCACCTGCCGTCTCCACCACAGGATGTACGCCAAGTTGCGCTTGTTCCGCGAGCGGT 840

ATCTCGGATACGAGCCCATGTTCCCAGTGTCCGAGTGCCAGGTGAACCCGGCGATCCTGTCGGCCCTCGA 910 TAGAGCCTATGCTCGGGTACAAGGGTCACAGGCTCACGGTCCACTTGGGCCGCTAGGACAGCCGGGAGCT 910

TCCCGGGGCCGGAGAGAACCACGACTTCTTCTCCGGCTCCGGCAGCGCATACGTCATCGGGAAGCAGAAA 980 AGGGCCCCGGCCTCTCTTGGTGCTGAAGAAGAGGCCGAGGCCGTCGCGTATGCAGTAGCCCTTCGTCTTT 980

CCCACCGAGGACGTGGACTGGAACTTCTGA 1080 GGGTGGCTCCTGCACCTGACCTTGAAGACT 1080

Secuencia de aminoácidos:

RPTTSIGCGRSSTGRMWDAGSRRRAPDARSTYGRRSAVSDRLVDRVHAINWNRVPDPKDA EVWDRLTGNFWLPEKIPLSNDLASWATLTDTEREMTIRVFTGLTLLDTAQATVGAVAMIA DAVTPHEEAVLTNMAFMESVHAKSYSSIFSTLCSTRQIDAAFEWSERNPHLQRKAQIVVD YYRGDDALARKAASVMLESFLFYSGFYLPMYWASHGELTNTADLIRLIIRDEAVHGYYIG YKCRKALERLDASARDAHRRYTYDLLETLYANEVAYAADLYDEVGWTAEVVSYMRFNANK ALANLGYEPMFPVSECQVNPAILSALDPGAGENHDFFSGSGSAYVIGKQKPTEDVDWNF

Diseño de primers para la amplificación del gen/es por PCR
Primer1: 5´ AGGCCGACTACATCGATCG 3´ Primer2: 5 ´ TCAGAAGTTCCAGTCCAC 3´

Estos dos primers izquierdo y derecho creados manualmente poco viables ya que al probarlos con el Primer3 nos dice que tienen diferentes tm y alta complementariedad 3´ en el primer izquierdo.

OLIGO start len tm gc% any 3' seq LEFT PRIMER 1 19 61.18 57.89 6.00 6.00 AGGCCGACTACATCGATCG RIGHT PRIMER 1080 18 51.30 50.00 5.00 2.00 TCAGAAGTTCCAGTCCAC

Tamaño de la secuencia: 1080 pb Tamaño incluído entre los primers: 1080pb Complementariedad entre primers: 6.00 Complementariedad del extremo 3': 0.00  ¿Tm de los primers? ¿A qué temperatura realizaría la amplificación? ¿Sitios de corte de losprimers?

Diseño de primers para amplificar fragmentos internos del gen/es y comprobar si dicho gen/es son esenciales o no para el microorganismo.
Ahora con el Primer3 buscamos los primers más óptimos dentro de la secuencia: OLIGO start len tm gc% any 3' seq LEFT PRIMER 220 20 60.34 50.00 4.00 0.00 GAGAAGATTCCGCTGTCCAA RIGHT PRIMER 617 20 60.02 50.00 5.00 0.00 AAGCCGCTGTAGAACAGGAA SEQUENCE SIZE: 1080 INCLUDED REGION SIZE: 1080

PRODUCT SIZE: 398, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 3.00

Este es el más óptimo pero el programa te calcula otros adicionales:

ADDITIONAL OLIGOS start len tm gc% any 3' seq

1 LEFT PRIMER 220 20 60.34 50.00 4.00 0.00 GAGAAGATTCCGCTGTCCAA RIGHT PRIMER 602 20 60.23 50.00 5.00 0.00 AGGAACGATTCGAGCATCAC PRODUCT SIZE: 383, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 1.00

2 LEFT PRIMER 220 20 60.34 50.00 4.00 0.00 GAGAAGATTCCGCTGTCCAA RIGHT PRIMER 605 20 59.70 45.00 5.00 3.00 AACAGGAACGATTCGAGCAT PRODUCT SIZE: 386, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00

3 LEFT PRIMER 585 20 60.23 50.00 5.00 0.00 GATGCTCGAATCGTTCCTGT RIGHT PRIMER 890 20 59.57 50.00 4.00 1.00 TTGAACCGCATGTAGGACAC PRODUCT SIZE: 306, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 2.00

4 LEFT PRIMER 585 20 60.23 50.00 5.00 0.00 GATGCTCGAATCGTTCCTGT RIGHT PRIMER 891 20 59.57 50.00 5.00 3.00 GTTGAACCGCATGTAGGACA PRODUCT SIZE: 307, PAIR ANY COMPL: 4.00, PAIR 3' COMPL: 3.0

Para comprobar si el gen es esencial para el microorganismo la manera más sencilla y práctica es producir una delección en el gen mediante Pcr de forma que quede no funcional. Si en el posterior cultivo del microorganismo no muestra ninguna diferencia es que este gen no es esencial para su funcionamiento.

Cojo los primers generados por Primer3 que sean mas eficaces y dentro los cojo a mano los complementarios:

1ºprimer: GAGAAGATTCCGCTGTCCAA 2ºprimer: TCAAGCTAGAAGAGCTGCG 3ºprimer: GTTCGATCTTCTCGACGC 4ºprimer: AACAGGAACGATTCGAGCAT

........TGCCCGAGAAGATTCCGCTGTCCAA CGACCTCGCCTCGTGGGCGACGCTGACCGACACCGAGCGAG 210 .........ACGGGCTCTTCTAAGGCGACAGGTTGCTGGAGCGGAGCACCCGCTGCGACTGGCTGTGGCTCGCTC 210

AGATGACCATCCGGGTGTTCACCGGGTTGACGTTGCTCGACACCGCGCAGGCCACCGTCGGAGCCGTCGC 280 TCTACTGGTAGGCCCACAAGTGGCCCAACTGCAACGAGCTGTGGCGCGTCCGGTGGCAGCCTCGGCAGCG 280

GATGATCGCCGATGCCGTCACCCCACACGAGGAGGCCGTCCTGACGAACATGGCCTTCATGGAGTCGGTG 350 CTACTAGCGGCTACGGCAGTGGGGTGTGCTCCTCCGGCAGGACTGCTTGTACCGGAAGTACCTCAGCCAC 350

CACGCCAAGAGCTACAGTTCGATCTTCTCGACGC TGTGCTCCACTCGGCAAATCGATGCGGCGTTCGAGT 420 GTGCGGTTCTCGATGTCAAGCTAGAAGAGCTGCG ACACGAGGTGAGCCGTTTAGCTACGCCGCAAGCTCA 420

GGTCGGAGCGCAACCCGCACCTGCAGCGCAAGGCGCAGATCGTCGTCGACTACTACCGCGGCGACGACGC 490 CCAGCCTCGCGTTGGGCGTGGACGTCGCGTTCCGCGTCTAGCAGCAGCTGATGATGGCGCCGCTGCTGCG 490

CCTCGCCCGCAAGGCGGCGTCGGTGATGCTCGAATCGTTCCTGT GGAGCGGGCGTTCCGCCGCAGCCAC TACGAGCTTAGCAAGGA 

=4.- Análisis de la proteina elegida.=

Diseño de primers para amplificar los genes que codifican para la/s proteína/s de interés con colas de histidina para su rápida purificación.
 Primer izquierdo: CCC GAATTC  GGGGAG AAGATTCCGCTGTCCAA Primer derecho: CCC <span style="color: rgb(255, 0, 0);">GAATTC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">GGGAGG <span style="color: rgb(0, 255, 255);"> <span style="color: rgb(0, 0, 255);">CGCCGCCGCCGCCGCCGC <span style="color: rgb(0, 255, 255);">AACGATTCGAGCAT

Hemos añadido un residuo de 6 histidinas (TAG) en extremo 3´ del primer derecho y hemos utilizado la secuencia de nucleotidos reconocida por EcoRI para la restricción.

Estudio de la/s proteína/s por bioinformática (dominios conservados, hidrofobicidad, estructura, características bioquímicas…..)
Los ribonucleótidos reductasa (RNR) catalizan la sintesis reductiva de desoxirribonucleotidos de sus correspondientes ribonucleotidos. Su unción es aportar los precursores para la sintesis de adn (ADN). Los RNR se dividen segun el cofactor metálico usado. En este caso es de tipo 2 y usan coenzima B12 (adenosilcobalamina, AdoCbl).<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);"> Faltan referencias. RNR es una enzima oligomerica compuesta por una larga <span style="color: rgb(255, 0, 0);">( Large en ingles se es grande en castellano) subunidad (700 a 1000 residuos) y una subunidad pequeña (300 a 400). En el tipo 2 son menos complejos, usan B12 en lugar de la cadena pequeña. Es una enzima multisubunitaria (dos subunidades idénticas B1 y dos subunidades idénticas B2) que es específica para la reducción de los nucleósidos difosfato (ADP, GDP, CDP y UDP) a su formas desoxi (dADP, dGDP, dCDP y dUDP). El donador inmediato de los átomos de hidrógeno necesitada para la reducción de el grupo 2'hidroxi son dos grupos sulfidrilos en la propia enzima, quien, durante la reacción, forma un puente disulfuro.

De la familia de las Ferritinas, la cual contiene 6 miembros: [|FA_desaturase_2] [| Ferritin] [| Mn_catalase] [| Phenol_Hydrox] Ribonuc_red_sm [| Rubrerythrin]

Ontología

 * Funcion molecular || [| ribonucleoside-diphosphate reductase activity] ([|GO:0004748]) ||
 * Proceso biologico || [| deoxyribonucleoside diphosphate metabolic process] ([|GO:0009186]) ||



Ribonucleotido reductasa de tipo 2 de E.coli (cursiva). Presenta 4 subunidades beta: 2 grandes(B1) en gris y dos pequeñas (B2) en verde.

Propiedades fisico-químicas:
Número de aminoácidos: 359

Peso molecular: 40339.2

Teorico pI: 5.46

Composición de aminoácidos: Ala (A) 43 12.0% Arg (R) 28 7.8% Asn (N) 14 3.9% Asp (D) 26 7.2% Cys (C) 4 1.1% Gln (Q) 6 1.7% Glu (E) 21 5.8% Gly (G) 20 5.6% His (H) 8 2.2% Ile (I) 14 3.9% Leu (L) 29 8.1% Lys (K) 10 2.8% Met (M) 9 2.5% Phe (F) 13 3.6% Pro (P) 14 3.9% Ser (S) 27 7.5% Thr (T) 23 6.4% Trp (W) 9 2.5% Tyr (Y) 18 5.0% Val (V) 23 6.4% Pyl (O) 0 0.0% Sec (U) 0 0.0% (B) 0 0.0% (Z) 0 0.0% (X) 0 0.0%

Número total de residuos cargados negativamente (Asp + Glu): 47 Número total de residuos cargados positivamente (Arg + Lys): 38

Composición atómica:

Carbon C 1791 Hydrogen H 2742 Nitrogen N 498 Oxygen O 542 Sulfur S 13

Formula: C1791H2742N498O542S13 Número total de átomos: 5586

Coeficientes de extinción:

Unidades del caeficiente de extinción M-1 cm-1, at 280 nm medido en agua.

Ext. coefficient 76570 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.898, assuming ALL Cys residues appear as half cystines Ext. coefficient 76320 Abs 0.1% (=1 g/l) 1.892, assuming NO Cys residues appear as half cystines

Vida media estimada: The N-terminal of the sequence considered is R (Arg).

La vida media estimada es de una hora (mammalian reticulocytes, in vitro). 2 min (yeast, in vivo). 2 min (Escherichia coli, in vivo).

Indice de estabilidad: 29.03 La proteina esta clasificada como estable. Indice alifatico: 77.27

Grand average of hydropathicity (GRAVY): -0.318

Mediante el programa PsortB, obtengo los siguientes datos: Localization Scores: Cytoplasmic 2.50 CytoplasmicMembrane 2.50 Cellwall 2.50 Extracellular 2.50 Como se puede observar la proteina se puede encontrar con la misma probabilidad en cualquiera de las localizaciones.

Péptido señal.
Buscamos el péptido señal con el Signal3, usando para ello neural network (NN) y hidden Marcov model (HMM). code length = 70 max. C   29       0.208   0.52   NO  max. Y   38       0.166   0.32   NO  max. S    7       0.680   0.97   NO  mean S     1-37    0.255   0.51   NO       D     1-37    0.211   0.45   NO
 * SignalP-NN result:**
 * 1) [|data]code
 * 1) Measure  Position  Value  Cutoff  signal peptide?

code
 * SignalP-HMM result:**

code [|data] code >hari Prediction: Non-secretory protein Signal peptide probability: 0.000 Max cleavage site probability: 0.000 between pos. -1 and 0

code Los datos muestran la ausencia de peptidos señal. TatP-NN result: code code data

length = 100 max. C 38 0.454 0.51 NO max. Y 67 0.193 0.35 NO max. S 45 0.909 0.75 YES mean S 1-66 0.769 0.30 YES max. D 1-66 0.481 0.36 YES
 * 1) Measure Position Value Cutoff Tat signal peptide?
 * 1) Most likely cleavage site between pos. 66 and 67: AGG-CG
 * 2) Potential Tat signal peptide but No Tat motif was found
 * 3) Used regex: RR.[FGAVML][LITMVF]

Los datos de las primeras pruebas muestran la ausencia de péptidos señal pero la prueba TatP nos informa del sitio mas propenso a la escision (entre la posicion 66 y la 67)

Dominios transmenbrana.
Esto se obtiene del analisis mediante TMHMM Resultados: My Length: 359 My TMHMM2.0 outside 1 359
 * 1) My Number of predicted TMHs: 0
 * 2) My Exp number of AAs in TMHs: 1.92562
 * 3) My Exp number, first 60 AAs: 0
 * 4) My Total prob of N-in: 0.10259

Vemos como la proteina esta libre, no atraviesa la menbrana, osea que no tiene dominios transmembrana pero aun asi existe una zona que tiene cierta liposolubilidad o se traba de alguna manera en ella.

Motivos de la proteina.








Hidrofobicidad
Se calcula con el ProtScale, puedes realizarlo de diferentes maneras segun cojas una escala u otra, en este caso se ha usado la de Abraham y Leo. Usando la escala de [|**Hphob. / Abraham & Leo**], los valores individuales de los aa son: code Ala: 0.440 Arg: -2.420 Asn: -1.320 Asp: -0.310 Cys: 0.580 Gln: -0.710 Glu: -0.340 Gly: 0.000 His: -0.010 Ile: 2.460 Leu: 2.460 Lys: -2.450 Met: 1.100 Phe: 2.540 Pro: 1.290 Ser: -0.840 Thr: -0.410 Trp: 2.560 Tyr: 1.630 Val: 1.730 : -0.815 : -0.525 : 0.399

code

code 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 edge center edge

MIN: -0.962 MAX: 1.662

code Se observa en la gráfica el perfil de hidrofobicidad.

Enzimas que cortan a mi proteina:


Enzimas que no son capeces:

Caspase10 Caspase2 Caspase3 Caspase4 Caspase5 Caspase6 Caspase7 Caspase8 Caspase9 Enterokinase Factor Xa GranzymeB Hydroxylamine Thrombin Tobacco etch virus protease

Mutagénesis in vitro del gen que codifica para la proteína elegida.
<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">porqué ha elegido esa mutación???

........TGCCC<span style="color: rgb(0, 255, 0);">GAGAAGATTCCGCTGTCCAA CGACCTCGCCTCGTGGGCGACGCTGACCGACACCGAGCGAG 210 .........ACGGGCTCTTCTAAGGCGACAGGTTGCTGGAGCGGAGCACCCGCTGCGACTGGCTGTGGCTCGCTC 210

AGATGACCATCCGGGTGTTCACCGGGTTGACGTTGCTCGACACCGCGCAGGCCACCGTCGGAGCCGTCGC 280 TCTACTGGTAGGCCCACAAGTGGCCCAACTGCAACGAGCTGTGGCGCGTCCGGTGGCAGCCTCGGCAGCG 280

GATGATCGCCGATGCCGTCACCCCACACGAGGAGGCCGTCCTGACGAACATGGCCTTCATGGAGTCGGTG 350 CTACTAGCGGCTACGGCAGTGGGGTGTGCTCCTCCGGCAGGACTGCTTGTACCGGAAGTACCTCAGCCAC 350 <span style="color: rgb(0, 0, 0);"> CACGCCAAGAGCTAC<span style="color: rgb(255, 0, 255);">AGTT <span style="color: rgb(0, 0, 255); background-color: rgb(0, 255, 255);">CGA <span style="color: rgb(255, 0, 255);">TCTTCTCGACGC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TGTGCTCCACTCGGCAAATCGATGCGGCGTTCGAGT 420 GTGCGGTTCTCGATGTCA <span style="background-color: rgb(255, 255, 255); color: rgb(0, 0, 0);">A <span style="background-color: rgb(0, 255, 255); color: rgb(0, 0, 0);">GCT <span style="color: rgb(0, 0, 0);">AGAAGAGCTGCG ACACGAGGTGAGCCGTTTAGCTACGCCGCAAGCTCA 420

GGTCGGAGCGCAACCCGCACCTGCAGCGCAAGGCGCAGATCGTCGTCGACTACTACCGCGGCGACGACGC 490 CCAGCCTCGCGTTGGGCGTGGACGTCGCGTTCCGCGTCTAGCAGCAGCTGATGATGGCGCCGCTGCTGCG 490

CCTCGCCCGCAAGGCGGCGTCG<span style="color: rgb(0, 0, 0);">GTGATGCTCGAATCGTTCCTGT GGAGCGGGCGTTCCGCCGCAGC<span style="color: rgb(0, 0, 0);">CAC <span style="color: rgb(0, 255, 255);">TACGAGCTTAGCAAGGA <span style="color: rgb(0, 0, 0);">

1ºPrimer: <span style="color: rgb(0, 255, 0);">GAGAAGATTCCGCTGTCCAA 2ºPrimer: <span style="color: rgb(0, 0, 0);">CAAGAGCTACAGTT <span style="color: rgb(0, 0, 255); background-color: rgb(0, 255, 255);">CCG <span style="color: rgb(0, 0, 0);">TCTTCTCGAC 3ºPrimer <span style="color: rgb(0, 0, 0);">GTTCTCGATGTCA <span style="background-color: rgb(255, 255, 255); color: rgb(0, 0, 0);">A <span style="background-color: rgb(0, 255, 255); color: rgb(0, 0, 0);">GGC <span style="color: rgb(0, 0, 0);">AGAAGAGCTGCG AC 4ºprimer: AGGAACGATTCGAGCAT

Con estos primers estoy mutando una Arginina por una Prolina.

==Diseño de primers para realizar fusiones génicas entre la/s proteína/s de interés con la proteína fluorescente verde para estudiar su localización celular o su concentración a lo largo del crecimiento del microorganismo.==

Primers para fusionar mi proteina con GFP:

El primer primer es el optimo de mi prot: 1ºPrimer: <span style="color: rgb(0, 255, 0);">GAGAAGATTCCGCTGTCCAA 2º Primer: <span style="color: rgb(128, 0, 128);">CTCCTTTACTCAT AACGATTCGAGCATCACCGACG 3º Primer: CGTCGGTGATGCTCGAATCGTT<span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; font-size: 8pt;">ATGAGTAAAGGAG 4ºPrimer 5’-<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; color: red; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">TTATTTGTATAGTTC

El último es el optimo derecho del GFP: ====<span style="background: silver none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; font-size: 8pt;">ATGAGTAAAGGAG AAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATG 0 ==== ====<span style="background: lime none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial; font-size: 8pt;">TACTCATTTCCTC TTCTTGAAAAGTGACCTCAACAGGGTTAAGAACAACTTAATCTACCACTACAATTAC 0 ====

ATGAACTATACAAATAA 717
==== TA<span style="background: yellow none repeat scroll 0% 0%; -moz-background-clip: -moz-initial; -moz-background-origin: -moz-initial; -moz-background-inline-policy: -moz-initial;">CTTGATATGTTTATT 717 ====


 * 5.- Escritura de un informe en castellano de la actividad realizada. **


 * RESUMEN:**

====Rhodococcus (cursiva) es una bacteria inmovil, gram positiva y que no esporula Como hemos podido ver con las pruebas realizadas esta cercanamente emparentada con Corynebacterium y Mycobacterium. No suelen ser potógenos y viven en casi todo el mundo.==== ====Se ha iniiciado el estudio del genoma de un representante de este género debido a que su importancia radica en la capacidad de otras especies para producir esteroides bioactivos, acrilamida y ácido acrílico. Además es importante en el proceso de degradación de productos contaminantes y la biodesulfuración de los combustibles fósiles.====

Se ha analizado la secuencia génica, así como la protéica, determinando sus características y comparándolas con bases de datos de microorganismos cercanos.
====Despues de realizar la busqueda de proteinas dentro de mi fragmento decidi analizar en profundidad la ribonucleotido difosfato reductasa subunidad beta que dentro del espectro de las ayadas me parecia de las más importantes ya que forma parte de una ribonucleotido reductasa, esta<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);"> combierte ribonucleotidos en desoxirribonucleotidos que son esenciales en la sintesis de adn por lo que es <span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">vitale en el microorganimo.====

<span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">Faltan referencias y el trabajo no está escrito como un trabajo científico.


 * Herramientas usadas:**

Para la obtención de la secuencia de DNA se han cultivado las cepas y aislado la molécula usando las instalaciones del departamento de Microbiología de la Universidad de León.Se ha empleado medio TSB o YEME líquido para crecer las bacterias en matraces.

Tras aislar el DNA y crear con él una genoteca se han enviado los distintos fragmentos a la unidad de secuenciación de la Universidad de León.

El análisis posterior se ha realizado mediante herramientas bioinformáticas, programas de tratamiento de secuencias genéticas y proteicas, bases de datos, etc. Estos aparecen referenciados en el cuerpo del trabajo cuando se ha considerado conveniente citarlos.

Agradecimientos:
====Agradezco a mis compañeros que me ayudaron en los momentos mas desafortunados, por todos los medios y facilidades a la Universidad de Leon y por supuesto a el profesor José A. Gil por darnos la asignatura y enseñarnos tantos conocimientos y herramientas y sobre todo por ayudarnos y facilitarnos aprobar la asignatura. ====

Referencias: <span style="background-color: rgb(255, 255, 0);">(en qué parte del texto se han citado estas referencias????)
===[|Rnr4p, a novel ribonucleotide reductase small-subunit protein.]===

PMID: 9315671 [PubMed - indexed for MEDLINE]
===[|Related Articles] [|Free article in PMC | at journal site]===

gi|241195787|ref|YP_002969342.1|[241195787]
===[|Formation and function of the Manganese(IV)/Iron(III) cofactor in Chlamydia trachomatis ribonucleotide reductase.]===

gi|237710423|ref|ZP_04540904.1|[237710423]
===Nordlund P, Eklund H;, J Mol Biol 1993;232:123-164.: Structure and function of the Escherichia coli ribonucleotide reductase protein R2. [|PUBMED:8331655] ===

===[|Modes of overinitiation, dnaA gene expression, and inhibition of cell division in a novel cold-sensitive hda mutant of Escherichia coli.]===

PMID: 18502852 [PubMed - indexed for MEDLINE]
===[|Related Articles] [|Free article in PMC | at journal site]===